DB34T 2814-2017 玉蜀黍赤霉检疫鉴定方法.docxVIP

ICS65.020.20B16

DB34

安徽省地方标准DB34/T2814—2017

玉蜀黍赤霉检疫鉴定方法

DetectionandidentificationofGibberellazeae(Schwein.)Petch

2017-03-30发布2017-04-30实施

安徽省质量技术监督局发布

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DB34/T2814—2017

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽省检验检疫科学技术研究院提出。

本标准由安徽省动植物检验检疫标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：安徽省检验检疫科学技术研究院。

本标准主要起草人：李云飞、陈雪娇、宗凯、孙娟娟、郑海松、姚剑、余晓峰、王满满。

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DB34/T2814—2017

玉蜀黍赤霉检疫鉴定方法

1范围

本标准规定了玉蜀黍赤霉的检疫鉴定方法。

本标准适用于小麦、玉米、水稻等禾谷类作物中玉蜀黍赤霉的检疫和鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3玉蜀黍赤霉基本信息

学名：Gibberellazeae(Schwein.)Petch

分类地位：真菌界（Fungi），子囊菌门（Ascomycota)，粪壳菌纲(Sordariomycetes)，肉座菌目(Hypocreales)，丛赤壳科(Nectriaceae)，赤霉属（Gibberella）。其无性阶段为禾谷镰刀菌（Fusariumgraminearum)。

传播途径：气流、雨水等是玉蜀黍赤霉病菌近距离传播的主要途径，受侵染的种子及病残体等植物性材料的调运是远距离传播主要途径。

4方法原理

根据玉蜀黍赤霉在寄主上的为害症状（参见附录A），培养基上生长的菌落、菌丝、分生孢子等形态特征，以及PCR特异扩增片段大小进行结果判定。

5仪器设备和主要试剂

5.1仪器设备

生物显微镜、体视显微镜、高速冷冻离心机、纯水仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、PCR仪、凝胶成像系统、电泳仪、培养箱、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器。

5.2主要试剂

5.2.1除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB/T6682的规定。

5.2.21％次氯酸钠。

5.2.3DNA提取试剂：DNA提取试剂盒，CTAB裂解液（20g/LCTAB，0.1mol/LTris，1.4mol/LNacl，20mmol/LEDTA-Na2），蛋白酶K（20mg/mL），苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，3mol/LNaAc(pH5.2)，异丙醇，70％乙醇，无菌水。

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5.2.4PCR试剂：10×PCRbuffer（含25mmol/LMgCl2），Taq酶，dNTP。

5.2.5凝胶电泳试剂：琼脂糖，TAE，LoadingBuffer，EB。

5.2.6马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯浸粉5.0g，葡萄糖20.0g，氯霉素0.1g，琼脂13.0g，蒸馏水定容至1000mL，调整pH值至5.6，121℃高压灭菌15min。

6病菌的鉴定

6.1分离培养

6.1.1种子病原菌的分离培养

取50g种子置于无菌水中室温浸泡处理1d，转入-20℃下冷冻处理1d，1％次氯酸钠消毒60s，无菌水洗涤3次后，灭菌滤纸吸干水分后按15粒/皿置于PDA培养基上，在25℃~28℃,12h黑暗/12h光照（12h光暗交替）条件下培养，第3d开始观察，根据种子周围新生菌落的形态和颜色进行选取,取边缘菌丝转接纯化。

6.1.2植株病原菌的分离培养

用解剖刀取植株病健交界处的组织，剪成约0.4cm×0.4cm小段，用1％的次氯酸钠溶液消毒60s，无菌水洗涤3次，灭菌滤纸吸干水分后置于PDA培养基上，同6.1.1培养纯化。

6.2鉴定特征

PDA培养基上菌落圆形，生长速度较快；气生菌丝较多，个别呈稀疏、絮状，初期白色，然后白至玫瑰色、白至洋红色或白至砖红色，中央常遗留黄色气生菌丝区；平板背面深洋红色或淡砖红至赭色。分生孢子近镰刀形、纺锤形、披针形，稍弯，