第五章--基因工程的酶学基础-.ppt

用于核酸操作的工具酶;限制性核酸内切酶(Restrictionendonuclease)是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列(4-8bp)，并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。;1973年H.OSmith和D.Nathans提议的命名系统，命名原则如下：;4.限制酶前面要带上R（Restriction)，修饰酶前面要带上M（Modification）。（现已省略）。;2.性质;I型限制性内切酶;首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌B株和K株分离的。;需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。;1970年，H.O.Smith和K.W.Wilcox首先从流感嗜血杆菌d株中分离出来。;;（3）粘性末端（stickyends，cohensiveends）;EcoRI等产生的5‘粘性末端;CTGCA?G;PstI等产生的3‘粘性末端;（3）粘性末端的意义;识别位点的序列相同的限制性内切酶。;;识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等;限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。;3.III型限制性内切酶;大部分II型核酸内切酶需要相似的反应条件：;II型核酸内切酶的多酶联合酶解：;II型核酸内切酶的多酶联合酶解：;DNA中的杂质如蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA、NaCl等都会影响酶的活性。;大肠杆菌中的dam甲基化酶在5‘GATC3’序列中的腺嘌呤N6位;不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37oC，少数要求40-65oC。;是影响限制酶活性的重要因素。;核酸内切酶的缓冲液性质：;六、限制性内切酶对DNA的消化;内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。;只有有限数量的酶切位点被切开。;5.几种常用限制酶识别位点;;从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能把两条DNA双链连接到一起的酶。;修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键;DNA连接酶;DNA连接酶;（1）大肠杆菌连接酶;（1）必须是两条双链DNA。;DNA连接酶的反应条件;第三节DNA聚合酶;1.共同特点;;热稳定聚合酶最适反应温度72℃,但能忍受96℃。

分子标记常用，有强的5’?3’DNA聚合酶活性，缺3’?5’活性，能扩增长达数千bp的DNA片段。