基因操作中大分子物质分离与分析.pptxVIP

基因操作中大分子物质分离与分析;目录;第一节

核酸提取纯化、检测与保留;DNA类型（起源）;第一个别DNA提取总论;一、提取DNA总标准：

;二、样本起源：;三、DNA提取基础步骤;各种组织细胞破碎方法;破裂细胞、释放核酸;2、核酸分离与纯化：

在含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其它物质分离：

非核酸大分子污染物（蛋白质、多糖和脂

类分子）、非需要核酸分子、试剂和溶液;3、核酸浓缩、沉淀与洗涤

沉淀可去除个别杂质与一些盐离子

加入一定盐类（醋酸钠、氯化钠等）后使用有机溶剂（如乙醇、异丙醇等）

少数盐类可使用70-75%乙醇洗涤;4、DNA判定;浓度判定;各种碱基紫外吸收光谱;2）荧光光度法

荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。

适合用于低浓度核酸溶液定量分析。（1-5ng）;EB与DNA结合;500?l全血提取基因组DNA电泳;纯度判定;1.DNA或RNA定量

OD260=1.0相当于

50μg/ml双链DNA

40μg/ml单链DNA（或RNA）

20μg/ml寡核苷酸

2.判断核酸样品纯度

DNA纯品:OD260/OD280=1.8

RNA纯品:OD260/OD280=2.0;完整性判定;基因操作中大分子物质分离与分析;DNA片段降解;完整或降解极少总RNA电泳图谱中，三条带荧光强度积分应呈特定比值，沉降系数大核酸区带，电泳迁移低，荧光强度积分高；反之，分子量小，电泳迁移率高，荧光强度积分低。

;普通而言，28S（23S）RNA荧光强度约为18S（16S）RNA2倍，不然提醒有RNA降解。若在点样孔附近有着色条带，则说明存在DNA污染。

;;5、核酸贮存——DNA保留;第二个别基因组DNA分离与纯化;一、DNA样品准备;二、DNA提取;DNA酚抽提法示意图;主要试剂作用：

EDTA：1二价金属螯合剂，抑制核酸酶；

2降低细胞膜稳定性;SDS作用：

1溶解膜蛋白和脂肪，从而使细胞膜破裂

溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸

释放出来

3对RNA、DNA酶有抑制作用

4与蛋白质形成R-O-SO3….R蛋白质复合物，使蛋白质变性;蛋白酶K：

水解蛋白质作用，消化DNA酶和细胞中蛋白质

蛋白酶K与其它蛋白酶相比，它含有更强水解能

力，而且在SDS、EDTA存在时仍保持较高活性，可

同时使用;苯酚特点：

蛋白??强变性剂、抑制DNA酶活性

苯酚溶于有机溶剂，微溶于水

提取DNA前苯酚用Tris-Hcl饱和，预防吸收过多DNA，降低DNA损失率

氧化苯酚会破坏DNA;为何苯酚要重蒸饱和后才能用于DNA分离？;PH8.0Tris溶液能够使得抽提出DNA进入水相，降低在蛋白质层滞留。

在酚或酚-氯仿中加入少许异戊醇，是能够降低试验中气泡产生，而且利于分相，保持分相稳定性。

;DNA沉淀;（二）甲酰胺解聚法：

破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA结合，再透析取得DNA。高浓度甲酰胺能够裂解蛋白质与DNA复合物，能够使蛋白质变性。降低了酚屡次抽提步骤

甲酰胺解聚法适合用于从标本中制备高分子量DNA样品。可得DNA200kb左右。;（三）玻璃棒缠绕法：

用盐酸胍裂解细胞，将裂解物铺于乙醇上，然后用带钩或U型玻璃棒在界面轻搅，DAN沉淀液绕于玻棒。生成DNA约80kb;DNA玻棒缠绕法示意图;基因操作中大分子物质分离与分析;（四）表面活性剂快速制备法：用TritonX-100或NP40表面活性剂破碎细胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。

;二、DNA浓缩

;三、DNA回收;（二）从聚丙烯酰胺凝胶回收DNA片段;DNA检测;DNA提取试验中常碰到问题;DNA降解原因

样本不够新鲜，采集材料过陈旧

样本本身存在大量DNA酶

提取DNA生物活性差原因

提取基因组DNA盐浓度过高

基因组DNA中乙醇未去除净

基因组DNA中可能存在其它抑制原因

提取基因组DNA，有时加入蔗糖原因

加入多糖，保护DNA长度;基因操作中大分子物质分离与分析;质粒DNA制备

plasmidextraction;质粒介绍

;ChromosomeDNAgenome;质粒特征

;

;质粒DNA提取和纯化

;二、细菌搜集(bacterialcollection)

;三、细菌裂解;质粒提取方法;质粒DNA提取方法选择

;l选择哪种方法制备质粒DNA，应考虑以下原因：

1．菌株类型（type）

2．质粒大小(size)

3．细菌染色