CRISPR系统Cas7-11效应蛋白的结构和功能研究.pdf

摘要

目的和意义：CRISPR（clusteredregularlyinterspacedshort

palindromicrepeats）-Cas（CRISPRassociatedprotein）系统是是一种

适应性很强的天然原核防御系统，可以抵抗入侵的病毒和质粒。

CRISPR-Cas系统从发现到功能的确定共经历了20余年的时间，近年

来其基本结构和作用机制逐渐得到阐明。目前研究表明，自然界中的

CRISPR-Cas系统根据效应复合物的组成形式不同，可将其分为第一

大类和第二大类：一类CRISPR-Cas系统利用多Cas蛋白效应复合物

来识别和切割靶标核酸，包括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型；二类CRISPR-Cas系统利

用单个较大的Cas效应蛋白发挥作用，包括Ⅱ、Ⅴ和Ⅵ型。其中，靶

向RNA的系统包括一类中的Ⅲ型系统和二类中的Ⅵ型系统。尽管

DNA靶向系统已经发展成为一套强大的遗传修饰工具，但靶向RNA

的CRISPR-Cas系统近几年才作为可编程的工具出现。作为生物医学

研究和基因治疗的强大遗传工具，由Cas13蛋白和crRNA组成的二

类VI型效应器已占据领先地位。目前，这一颠覆性技术的“脱靶效

应”一直是阻碍其临床应用的关键障碍之一，所以迫切需要发现兼具

高特异性和低细胞毒性的Cas效应蛋白。2019年，Ⅲ-E型CRISPR-

Cas系统被发现。随后，两项研究确定了Ⅲ-E型CRISPR-Cas系统的

特征，分别被Özcan等人称为Cas7-11，被vanBeljouw等人称为

gRAMP，并证明了它们作为高度特异、可编程、一体化RNA靶向系

统的适用性。Cas7-11效应蛋白以其结合的crRNA为导向，在相隔6

个核苷酸的两个位置促进靶RNA的高度序列特异性切割。该系统的

发现为序列特异性RNA打靶提供了一种新的工具，可用于基因敲低

和基因编辑，且脱靶效应可忽略不计，细胞毒性低。同时该系统的另

外一个独特之处是它能够与另外一个被称为TPR-CHAT的Caspase相

关的蛋白酶系统偶联，激活并特异性切割下游效应蛋白，进而诱导原

核细胞凋亡及共同参与宿主的病毒免疫进程。Cas7-11蛋白可与

crRNA和TPR-CHAT蛋白形成稳定的复合物，被称之为Craspase复

合体。鉴于该系统在生物医学和治疗应用方面具有广阔前景，Craspase

复合体有望成为基因治疗和生物医学研究的工具，但目前人们对其调

控机制知之甚少。为了解释第一大类CRISPR系统中效应蛋白从多组

i

分向单一组分的演化，并提供了一种兼具高特异性和低细胞毒性的新

RNA编辑工具CRISPR-Cas7-11，以及Craspase复合体进一步推动

RNA编辑技术的发展和临床应用转化，了解其调控机制显得至关重

要。

研究方法与研究成果：为了研究Craspase复合体调控的结构基

础，本实验研究了来自Desulfonemaishimotonii的III-E型CRISPR基

因座，获得了Cas7-11和TPR-CHAT的基因序列。为了得到复合物

Cas7-11-crRNA，通过将含有Cas7-11基因的质粒和含有crRNA基因

质粒共转，并借助冷冻电镜技术得到了分辨率为3.4Å的Cas7-11-

crRNA二元复合物结构，以及分辨率为2.5Å的缺乏Cas11结构域的

Cas7-11-crRNA二元复合物结构；为了得到复合物Cas7-11-crRNA-

TPR-CHAT，本实验构建了两个载体共转并进行蛋白的表达和纯化，

并通过冷冻电镜技术得到了两种结构，分别是分辨率为2.8Å的Cas7-

11-crRNA-TPR-CHAT的三元复合物结构，以及分辨率为