巨大芽胞杆菌hj-4发酵产维生素c的影响因素.docxVIP

巨大芽胞杆菌hj-4发酵产维生素c的影响因素 维生素c，也被称为l-抗凝剂，是人体所必需的维生素和氨基酸。作为人体所需的维生素和氨基酸，它受到了人们的广泛关注，并在食品、药物、农产品开发等领域得到了广泛应用，需求日益增加。上世纪70年代我国学者尹光琳发明了“二步发酵法”生产Vc,该方法工艺简单、成本低、“三废”少,已成为我国Vc工业生产的主要方法。其中第2步将L-山梨糖转化为Vc前体2-酮基-L-古龙酸,由产酸菌—氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)和伴生菌—巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)共同完成。产酸菌单独生长和传代困难,对伴生菌依赖性较强。目前已知具有伴生能力的菌属有芽胞杆菌、假单胞菌、欧文氏菌、微球菌、荧光杆菌、变形菌、肠杆菌和酵母菌等,但由于伴生能力较差,促产酸不稳定,菌株易污染等多方面因素,生产中常用的依然是巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium),菌种较单一。本文以短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)HJ-04作为伴生菌与产酸菌搭配,发现其能更好地促进产酸菌生长及产酸,经响应面优化后新菌系的产酸量进一步提高,产酸周期缩短,具有良好的科研价值及应用前景。 1 材料和方法 1.1 氧化葡萄糖酸杆菌 巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)B2980和氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans),由东北制药总厂提供。短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)HJ-04由沈阳农业大学生化实验室提供。 1.2 方法 1.2.1 接种培养基培养 ①混合菌种子培养:150 mL三角瓶装液量20 mL,向混合菌斜面中加入少量无菌水,刮下菌苔并混匀。吸取1 mL菌液接种到种子培养基中,29 ℃、180 r/min振荡培养24 h;②混合菌发酵培养:150 mL三角瓶装液量10 mL,吸取1 mL产酸菌种子培养液接种到发酵培养基中,29 ℃、180 r/min振荡培养48 h。 1.2.2 -ka生成量的测定 取2 mL发酵液于试管中,加入2 mL 7 mol/L H2SO4,100 ℃煮沸30 min。冷却后以1%淀粉作指示剂,用0.05 mol/L I2溶液滴定至蓝色为反应终点。按以下公式计算2-KGA生成量。 2-KGA(mg/mL)=M×V×0.08806×1000A×B×0.9072(mg/mL)=Μ×V×0.08806×1000A×B×0.9072 其中,M为I2溶液浓度(0.05 mol/L×2);V为I2溶液消耗体积(mL);A为2-KGA转化为Vc的转化率(%)(以63.1%计算);B为所取发酵液体积(mL);0.907 2为Vc分子量/2-KGA分子量;0.088 06为1 mL I2溶液相当于8.806 mg Vc。 1.2.3 反应分析 使用Design-Expert软件进行响应面设计及分析。 1.2.4 混菌生长产酸影响因素筛选 ①单因素试验设计:其他因素不变,对发酵培养基主要营养物质L-山梨糖、尿素、玉米浆、碳酸钙分别设计5水平的单因素试验,接种后,28 ℃,180 r/min摇床培养48 h,每组重复3次,测定2-KGA含量,并计算糖酸转化率,分析各因素对混菌发酵产酸的影响;②Plackett-Burman试验设计:除碳源、氮源外,混菌生长产酸还需要多种无机盐及生长因子,利用Plackett-Burman试验可有效筛选对产酸影响显著的因素,进行响应面优化。根据文献记载,选择L-山梨糖、尿素、玉米浆、KH2PO4、MgSO4、CaCO36个因素作为考察对象,设计12组的Plackett-Burman试验,接种后,28 ℃,180 r/min摇床培养48 h,测定2-KGA含量,重复3次,分析数据筛选显著影响因子,各因素水平选择见表1;③响应面试验设计:筛选出显著影响因子后,以L-山梨糖、尿素、玉米浆浓度为自变量,2-KGA产量为响应值,采用Box-Behnken设计法设计3因素3水平的17组试验。根据单因素试验结果,以产酸量最大值对应的各因素浓度作为自变量中心点,利用公式xi=(Xi-X0)/ΔX对自变量进行编码,其中xi为自变量编码值,Xi为自变量真实值,X0为中心点处自变量真实值,ΔX为自变量变化步长,编码水平见表2。发酵液接种后,28 ℃,180 r/min摇床培养48 h,测定2-KGA含量,重复3次,进行响应面分析。 2 结果与分析 2.1 -酮基-l-龙 以实验室筛选的短小芽胞杆菌HJ-04和工业生产用菌株巨大芽胞杆菌B2980作为伴生菌分别与氧化葡萄糖酸杆菌搭配,测定发酵产2-酮基-L-古龙酸(2-keto-L-gulonic acid,2-KGA)量随时间变化(图1)。结果显示