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流式细胞仪的原理与应用 流式细胞仪是流式细胞艺术的典型工具。它可以快速分析单个细胞及其组成部分的药物含量和类型，并对含有特定化学物质的细胞进行分类。 1 流式细胞仪的主要组成 流式细胞仪一般由液流系统、激发光器件、信号检测系统和控制系统四大基本组件构成。具有细胞分选功能的流式细胞仪还有分选系统(见图1)。 2 过测量区的原理 流式细胞术(FCM),顾名思义就是细胞在流动状态下的检测技术。流动的悬浮在液体中的分散细胞一个个地依次通过测量区,该测量区是激光与液流交汇之处,带有特异性荧光标记抗体的细胞当暴露于488nm蓝绿激光束时,染色的细胞发出荧光荧光染料受到激光激发释放一定波长的光这些信号转化为电信号,再进一步被测量、存储、显示,细胞的一系列重要的物理特性和生化特征,如大小、内部结构、DNA、RNA蛋白质、抗原等就被快速地,大量地测定。 2.1 流式细胞仪检测细胞的方法原理 主要是由鞘液、细胞悬液和流动室组成。在气体压力的作用下,流动室内充满的鞘液从喷嘴喷出形成鞘液流,细胞悬液在鞘液流的吸引下和气体压力的作用下经导管输入流动室,正对流动室的喷嘴喷射。细胞悬液内的细胞在鞘液流的约束下排列成单列,由流动室的喷嘴喷出,成为细胞液柱。 激光器件产生光束,与细胞液柱垂直相交,相交点即为测量区。激光器是使用最多的发光器件,也有用汞灯和氙灯作为流式细胞仪的激发光源。 信号检测系统由特异信号检测器件和非特异信号检测器件构成。当细胞液柱内的细胞经过测量区时,在激发光的照射下,产生特异的荧光信号和非特异的前向角散射与侧向角散射信号,荧光信号由PMT检测,前向角散射由光电二极管检测。因此,流式细胞仪可同时检测同一个细胞的至少三种参数。荧光信号的种类与产生荧光的化学物质以及与特异荧光色素结合的化学物质有关,90o侧散射光的大小与细胞内部的颗粒有关,前向角散射光的强度与细胞的大小有关,尽管如此,流式细胞仪对细胞形态的分辨率为零。现在已有同时使用三个不同的波长的激光器,同时检测同一细胞的九种荧光信号和两种非特异的前向角散射与侧向散射信号共11个参数的流式细胞仪,这对丰富人们对细胞化学物质间的相互关系的认识具有极大的作用 细胞分选系统首先使流动室上方的超声振荡器产生机械振动,导致流动室随之振动,于是细胞液柱断裂成一连串均匀的液滴,当包有细胞的液滴经过测量区时,信号的检测系统对其特异信号进行检测,如果其特性与要分选的细胞特性相符,则控制系统给这个细胞液滴充以指定的电荷,当这个带有电荷的细胞液滴向下落入偏转板的高压静电场时,依所带电荷落入指定的收集器内,完成对细胞的分类收集。 控制系统是流式细胞仪控制中枢,负责对整个仪器的调试、设置、控制和测量参数的分析。 3 流式细胞仪的应用 3.1 科研应用 主要用于细胞动力学功能研究、环境微生物分析、流式细胞术与分子生物学研究。 3.2 临床应用 3.2.1 fcm的作用 这是FCM在临床医学中应用最早的一个领域。首先需要把实体瘤组织解聚、分散制备成单细胞悬液,用荧光染料(碘化吡啶PI)染色后对细胞的DNA含量进行分析,将不易区分的群体细胞分成三个亚群(G1期,S期和G2期细胞亚群),DNA含量直接代表细胞的倍体状态,非倍体细胞与肿瘤恶性程度有关。 (1)发现癌前病变,协助肿瘤早期诊断。FCM可精确定量显示DNA含量的改变,作为诊断癌前病变发展至癌变中的一个有价值的标志,能对癌前病变的性质及发展趋势作出估价,有助于癌变的早期诊断。 (2)在肿瘤的诊断、愈后判断和治疗中的作用:FCM在肿瘤诊断中的重要作用已经被认可,DNA非整倍体细胞峰的存在可为肿瘤诊断提供有利的依据,FCM分析病变细胞具有速度快、信息量大:敏感度高等优点,已被用在常规工作中。肿瘤细胞倍体分析对病人愈后判断有重要作用,异倍体肿瘤恶性病变的复发率高、转移率高、死亡率也高,而二倍体及近二倍体肿瘤的愈后情况则较好。 FCM不仅可以对恶性肿瘤含量进行分析,还可根据化疗过程中肿瘤分布直方图的变化去评估疗效了解细胞动力学变化,对肿瘤化疗具有重要的意义。临床医师可以根据细胞周期各时相的分布情况,依据化疗药物对细胞动力学的干扰理论,设计最佳的治疗方案,从DNA直方图直接地看到肿瘤细胞的杀伤变化,及时选用有效的药物,以对肿瘤细胞达到最大的杀伤效果。 此外,FCM近几年还被应用于细胞凋亡和多药耐药基因的研究中。FCM对多药耐药基因(P170等)凋亡抑制基因及凋亡活化基因表达测定,可为临床治疗效果分析提供有利依据。 3.2.2 血栓性疾病的诊断和监控 (1)检测白血病和淋巴瘤细胞;(2)检测活化血小板:血小板的活化是血栓形成的重要环节,检测血小板的活化状态可以辅助诊断和监控血栓性疾病,对判断血栓前状态的意义也非常重大;(3)造血干细胞(CD34+)计数;(4)白血病免疫分型:C