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基于蛋白-蛋白相互作用的后基因组学研究进展 蛋白质是细胞生命活动的执行者，通过蛋白质和蛋白的相互作用（直接或间接）来完成其作用。虽然不是所有的蛋白都是通过相互作用来实现其功能的,但是鉴定与某一已知蛋白相互作用的蛋白功能,可以从已知的蛋白来推断。系统地全面地研究蛋白-蛋白相互作用(静态的和动态的)能够便于描述蛋白的功能。研究蛋白-蛋白相互作用的方法很多,酵母杂交系统是其中最常用的检测体内蛋白-蛋白相互作用方法,并且目前已知的蛋白质相互作用至少有1/2是通过酵母双杂交实验发现的。 1 ad-y质粒载体的构建 1.1转录相关的杂交系统(经典酵母双杂交系统)酵母双杂交系统是在对酵母GAL80蛋白插入一段氨基酸序列后转化成转录激活子,在与GAL4的DNA结合域的相互作用的研究基础上由Fields和Song设计的。GAL4蛋白有2个分离的功能必需结构域:N端1～174位氨基酸区段的DNA结合域(DNA binding domain,DNA-BD)和位于C端768～881位氨基酸区段的转录激活域(activation domain,DAN-AD)。N-端DNA结合域(BD)能够识别位于GAL4效应基因(GAL4-responsivegene)的上游激活序列(upstream activating sequence,UAS)并与之结合,但不能激活转录;C-端是转录激活必需的(AD),但不能结合DNA序列(UASG)(如图1)。即两者共同存在时,形成完整的转录因子才能转录激活下游基因表达。 将BD与已知的诱饵蛋白质(bait protein)X融合,构建出BD-X质粒载体;将AD基因与随机的DNA片段或者cDNA文库融合(preys,以Y表示),构建出AD-Y质粒载体。2个穿梭质粒载体共转化至酵母体内表达,该酵母菌株含有特定报告基因(如LacZ,HIS3,LEU2等)。蛋白质X和Y的相互作用导致了BD与AD在空间上的接近,从而激活UAS下游启动子调节的报告基因的表达,使转化体由于HIS3或LEU2表达而可在特定的缺陷培养基上生长,从而证明蛋白质X和Y发生相互作用。 1.2细胞质相关杂交系统-泛素切割系统(splitubiquitin system)泛素是一种76个氨基酸的信号结构蛋白,与另外的一种蛋白的N端连接,在体内能被识别泛素折叠形式的泛素特异性蛋白酶(Ubspecific proteases,UBPs)剪切。利用这一特性,将X蛋白与泛素C端,Y蛋白(未知)与泛素N端(含错义突变)分别融合相连,如果泛素的C端和N端融合的蛋白相互作用就可以重构泛素的作用。可以检测蛋白的相互作用,而且也可以用于检测蛋白相互作用中的动力学性质。 1.3三杂交系统(three-hybrid system)该系统是在经典双杂交系统上发展来的,检测某些情况下仅仅在核内存在第3方蛋白Z时,蛋白Y才能与蛋白X发生相互作用。 RNA-蛋白相互作用在转录、mRNA的加工、早期发育和RNA病毒的感染中发挥重要的作用。双功能RNA(bifunctional RNA)能与2个杂交蛋白相互作用,在中间起着桥梁的作用,使得转录因子重建而报告基因得到表达。 1.4反式双杂交系统(reverse two-hybrid)该杂交系统能分析某一蛋白由于突变、药物作用或竞争蛋白抑制作用导致的与已知蛋白的相互作用中断,Vidal等对转录因子启动的报告基因进行改造,使得报告基因的表达在特殊的生长条件下产生毒性进行反向选择标记,检测蛋白X与蛋白Y在突变情况下无相互作用(图2)。 1.5信号通路杂交系统Aronheim等对经典的酵母双杂交系统做了重大的改进,构建了SOS恢复系统(sos recruitment system,SRS),一种膜相关双杂交系统(membrane-associated two-hybrid system)。它主要是利用了一种Cdc25-2温度敏感性的酵母菌株,该菌株缺乏Ras鸟苷酸交换因子(guanyl nucleotide exchange fac tor,GEF),而不能将细胞外信号传递给膜上的Ras蛋白,致使该酵母突变体在36℃不能存活,而可以在25℃条件下生长;如果引入正常的同源人的GEF(hSos蛋白),并且使得hSos能与Ras蛋白相互作用,将细胞外信号传递到胞内,该酵母突变体则可以在36℃下存活,因此可以将hSos与蛋白质X融合,将蛋白质Y(cDNA编码产物)与膜定位信号(肉豆蔻酰化或法呢酯化信号)融合富集到细胞膜上。这样,若X与Y结合,X融合的蛋白hSos就会定位于膜上,从而得以靠近膜上的Ras蛋白,激活ras途径,完成Sos过程,该酵母突变体在36℃条件下就能生长而得以筛选出来,能够生长也就证明蛋白X与Y发生了相互作用。 2 snr6基因的转录表达 利用酵母杂