碱性亮氨酸链bzp1基因的转录调控与作用机理.docxVIP

碱性亮氨酸链bzp1基因的转录调控与作用机理 氨基酸碱链bzp（基本le历性锁）是植物中的一个非常重要的预测因素家族。拟南绍有75个家族。它们具有以下共同特点：纳入与特定dna序列相结合的碱性结构域；具有负载量作用的亮氨酸链的碱性区域与碱性区域密切相关。以二聚体二聚体形式的dna；乙烷链纳米段的碱性区域与dna直接结合。 bZIP类转录因子在植物生长发育、光形态建成、光信号传导以及抗逆境胁迫过程中起重要的作用.研究表明,AtbZIP10通过与其它bZIP类转录因子(AtbZIP53、AtbZIP9、AtbZIP25)相互作用调节脯氨酸脱氢酶基因(proline dehydrogenase,proDH)和种子成熟基因(seed maturation genes,MAT)的表达,最终调控植物的生长发育和种子的成熟[6~8].ABI5和ABI3参与ABA信号传导途径,并在种子成熟和萌发中发挥着重要的作用.bZIP类转录因子与植物非生物胁迫应答密切相关,拟南芥A亚家族(ABF1、ABF2/AREB1、ABF3、ABF4/AREB2),F亚家族(AtbZIP24)等都通过ABA依赖途径或ABA非依赖途径调控拟南芥对非生物胁迫的耐性[12~14].水稻OsbZIP72和OsbZIP23基因能够提高水稻对盐和干旱胁迫的抗性;大豆GmbZIP132基因超量表达使转基因拟南芥对低温、高盐的耐性较野生型明显提高.bZIP类转录因子HY5参与植物的光形态建成.在黑暗条件下,COP1(植物光形态建成调控因子)在细胞核内积累,HY5与其相互作用,并调控其降解.而在光下,COP1从细胞核内转移到细胞核外,使HY5在细胞核内积累,与查尔酮合成酶基因(CHS)等光诱导基因启动子特异性结合,正调控相关基因的表达,启动光形态建成. 目前,对bZIP相互作用蛋白的研究还比较少,而蛋白质互相作用对研究基因信号传导通路与调控机制具有重要作用.本研究利用酵母双杂交系统,以无激活特性的AtbZIP1(Arabidopsis thaliana basic leucine zipper 1)缺失突变体AtbZ3为诱饵蛋白,构建拟南芥cDNA文库,筛选AtbZIP1相互作用蛋白.经序列分析发现包括叶绿体ATP合成酶CF0亚基,组氨酸磷酸转移激酶AHP2,过氧化氢酶CAT2,Gly富含蛋白GPR2,bHLH家族转录因子.亚细胞定位分析表明,AtbZIP1除了定位于细胞核外,还定位于叶绿体.由此推论,AtbZIP1基因可能参与光信号传导和非生物胁迫等生物学过程,为进一步研究AtbZIP1转录因子基因的功能及其分子机制奠定了基础. 1 材料和方法 1.1 主要试剂和仪器 酵母AH109菌株、Y2H菌株、pGBKT7和pGADT7-Rec质粒购自Clontech公司,大肠杆菌DH5α菌株和亚细胞定位载体pCEF、原核表达载体pET32b由东北农业大学植物生物工程研究室保存. 双杂交文库构建系统(Make Your Own“MatePlateTM”Library System)、酵母双杂交系统(MatchmakerTMGold Yeast Two-Hybrid System)、Aureobasidin A(AbA)购自Clontech公司,酵母质粒提取试剂盒(TIANprep yeast plasmid DNA kit)和总RNA提取试剂盒(plant RNAprep Plant Kit)购自北京天根生化公司,总RNA提取试剂盒(RNeasy Plant Mini Kit)购自Qiangen公司,Reverse Transcriptase M-MLV RNase H-,Primer Star高保真酶,限制性内切酶和连接酶等分子生物学试剂购自TaKaRa公司,PCR引物合成及测序由上海生工生物公司完成. 1.2 扩增atbcip1基因回复突变体的构建 采用滤纸桥培养法培养拟南芥幼苗,培养22 d后,采用plant RNAprep Plant Kit试剂盒提取幼苗总RNA,并通过Reverse Transcriptase M-MLV RNase H-试剂盒反转录合成cDNA模板.用基因特异引物(5′-TTTCCATGGTTATGGCAAACG-3′和5′-AAAGAGCTCCTTGTCTTAAAGGACG-3′)通过高保真聚合酶Primer star PCR扩增AtbZIP1基因CDS区(435 bp),同时在其两端引入NcoⅠ和SacⅠ酶切位点,将PCR产物回收,并与pET32b载体同时进行双酶切,酶切产物回收后采用T4 DNA连接酶连接过夜,并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,PCR鉴定得到阳性转化子.在pET32b载体HIS6标签后设计引物(5′-AAACTGCAGGTGGTGGTGG