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米曲霉蛋白酶主要成分分离及其酶学性质研究 酶是一种含有可水解蛋白中氨基酸或酪氨酸酶的酶。这是世界上第三个酶制剂之一，占世界酶制剂产量的60%。主要来自动物、植物和微生物。一般来说，虽然它不含有有毒反应，但如果水解反应完成，它将自身死亡。因此，它在食品行业中得到了广泛的应用。 蛋白酶水解蛋白质具有效率高、条件温和、能提高蛋白质的营养价值等多项优点。不同的蛋白酶有不同的酶切方式, 对氨基酸残基形成的肽键有其酶解专一性, 因此当不同的蛋白酶作用于同一底物时, 会产生不同的氨基酸或小肽水解物, 使蛋白水解物具有不同的口味和功能特性。米曲霉是公认的食品安全菌株, 具有很强的蛋白酶合成能力, 其蛋白酶在较广的p H范围内均具有活性, 另外由于米曲霉含有丰富的糖苷水解酶, 可以利用淀粉或纤维素等廉价原料高效生产蛋白酶, 所以米曲霉是食品用蛋白酶的主要来源菌株。多年来对米曲霉蛋白酶的研究, 主要集中在发酵过程中蛋白酶活力测定, 诱变菌株提高活力等方面。另外, 张贺迎等用活性电泳方法分析发现米曲霉能分泌多种蛋白酶, 曾小波等用硫酸铵沉淀、凝胶柱层析方法初步分离出一种内肽酶和一种外肽酶, 除此很少有关于米曲霉各蛋白酶组分酶解特性的深入研究, 影响了对米曲霉蛋白酶的充分利用。 本文对一株米曲霉所产蛋白酶系进行了分离纯化, 并对获得的蛋白酶组分进行酶学性质及酶解特性研究, 为米曲霉所产蛋白酶在食品上的应用提供指导。 1 材料和方法 1.1 培养基培养条件 1.1.1菌株:米曲霉 (Aspergillus oryzae) , 本研究中心筛选和保藏。 1.1.2原料:麸皮、马铃薯为市售;大豆分离蛋白购自哈尔滨高科大豆食品有限公司;酪蛋白、牛血清蛋白购自国药集团化学试剂有限公司。 1.1.3培养基及培养条件:种子斜面培养基 (g/L) : 马铃薯200, 蔗糖20, 琼脂20;种子培养条件: 30 °C静置培养5 d。发酵固体培养基:麸皮与水按1:1 (体积比) 比例搅拌均匀;发酵培养条件:接3环斜面菌种于发酵培养基中, 充分摇匀, 30 °C培养36 h, 24 h时扣瓶。 1.1.4主要试剂和仪器:DEAE-Sepharose FF 、 Phenyl-Sepharose HP、Sephadex-G75/200预装柱, 购自Pharmacia公司;低相对分子质量蛋白质Marker, 购自Ta Ka Ra公司;丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、十二烷基硫酸钠 (SDS) 、考马斯亮蓝R250/G250、TEMED, 购自Sigma公司; 其它试剂均为分析纯或生化试剂。 AKTA蛋白纯化, Purifer系统。 1.2 酶活的测定 1.2.1蛋白酶酶活测定:采用Folin-酚法。 1.2.3粗酶液的提取:将发酵好的培养物按照质量体积比1:3加入生理盐水, 37 °C摇床振荡1 h, 过滤, 滤液即为粗酶液。 1.2.4硫酸铵盐析:取一定体积粗酶液, 加入硫酸铵粉末至40%饱和度, 4 °C静置5 h后, 8 000 r/min离心10 min, 取上清液补加硫酸铵至80%饱和度, 4 °C静置过夜, 8 000 r/min离心10 min后, 沉淀用0.02 mol/L Tris-HCl (p H 7.5) 缓冲液溶解。 1.2.5 DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析:透析脱盐后的沉淀蛋白, 加样于用0.02 mol/L Tris-HCl (p H 7.5) 缓冲液平衡的DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱, 用平衡液充分衡洗, 将未挂上柱的蛋白充分洗脱下来 (衡洗阶段) 后, 用0.5 mol/L Na Cl溶液以2.0 m L/min的流速进行线性梯度 (0-30%) 洗脱 (洗脱阶段) , 收集浓缩衡洗阶段和洗脱阶段的酶活组分。 1.2.6 Phenyl-Sepharose HP疏水层析:将1.2.5中的浓缩酶液与3 mol/L硫酸铵溶液等体积混和后加样于用1.5 mol/L硫酸铵溶液平衡好的Phenyl-Sepharose HP疏水柱。用0.02 mol/L Tris-HCl (p H 7.5) 缓冲液进行线性梯度 (0-100%) 洗脱, 流速2.0 m L/min。收集浓缩酶液, 并进行脱盐处理。 1.2.7 Superdex-G75/200凝胶层析: 用含0.15 mol/L Na Cl的0.02 mol/L Tris-HCl (p H 7.5) 缓冲液平衡凝胶柱, 将1.2.6中的浓缩酶液加样于凝胶柱, 平衡液洗脱, 流速0.5 m L/min。收集酶活峰, 即为纯酶液。 1.2.8纯度、相对分子质量测定及酶谱检测:纯度和相对分子质量测定采用SDS法。酶谱检测按SDS稍加改进, 样品与上样缓冲液混合后不经煮沸处理,