SNT 1705-2006出入境口岸森林脑炎检验规程.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1705---2006出入境口岸森林脑炎检验规程Examination codes for tick-borne encephalitis at entry-exit port2006-01-26 发布2006-08-16 实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局数码防伪 SN/T 1705—2006前言本标准的附录 A为规范性附录,附录 B为资料性附录。本标摊由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国吉林出入境检验检疫局、吉林省职业病医院。本标准主要起草人：杨怀宁、冯华、王勇、董思杞、赵大力、刘金华、浦昀。本标准为首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 1705---2006出入境口岸森林脑炎检验规程1范围本标准规定了人出境口岸森林脑炎的检验方法、结果报告、阳性结果处置。本标准适用于人出境口岸的森林脑炎检验。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的必威体育精装版版本。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本适用于本标准。GB19489实验室生物安全通用要求3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1森林脑炎tick-borne encephalitis (TBE)又称苏联春夏脑炎或远东脑炎，是由黄病毒科黄病毒属森林脑炎病毒经硬蜱叮咬所致自然疫源性急性中枢神经系统传染病。临床特征是突发高热、意识障碍，头痛、项强、上肢与颈部及肩胛肌瘫痪，后遗症多见。4 标本处理4.1 血液标本血液标本采集后，冷藏条件下迅速送实验室，当日分离血清。4.2蜱标本采集的蜱先冰冻，然后将每个蜱分别置于5%的Chelex100树脂溶液中（每个若虫置于200uL溶液中，每个成虫置于500L溶液中）。每次在一个试管中用锋利的手术刀片切一个蜱，蜱的成虫切成4块～6块，若虫切成2块一4块，此过程要在液面以下进行，手术刀片在切下→只蜱之前要用火焰消毒。含有样品的试管经涡轮振荡后于56℃孵育过夜，随后将样品在98℃～100℃孵育15min，涡轮振荡10s，冰浴并离心，取上清作检验。5 准备检验设备、器材及试剂的准备见附录A6 实验室检验方法6. 1 间接免疫荧光检验按商品化试剂盒的说明书操作，下面以欧蒙抗TBE抗体（IgG，IgM)间接免疫荧光法检测试剂盒I)为例。1）该试剂盒是由欧蒙(德国)医学实验诊断股份有限公司提供的产品商品名，是适合市售产品的实例，给出这一信息是为了方便本标准的使用者,并不表示对这一产品的认可。11 SN/T 1705—20066.1.1 准备检验IgG类抗体：待测标本用样品缓冲液1：10稀释。例如：取11.1uL样品用100μL样品缓冲液稀释并充分混勾。检验IgM类抗体：检验特异性的IgM抗体前，应除去血清中的IgG型的抗体，可以用超速离心，层析或免疫吸附的方法进行。待测标本用欧蒙吸附剂以1：10稀释（如：在100μL欧蒙吸附剂中加人11.1μL血清，充分混匀，旋涡混匀器振荡4 s）。室温温育15 min后离心（5 min，2000 r/min）。6.1.2加样将加样板放在泡沫板上，按顺序分别滴加25uL稀释后血清至加样板的每一反应区，避免产生气泡。加完所有待测标本后再开始温育（最多200份）。6.1.3 温育将载片覆有生物薄片的一面朝下，盖在加样板的凹槽里，反应立即开始。确保每一样品均与生物薄片接触且样品间互不接触。室温（18℃～25℃）温育30min。6.1.4冲洗用烧杯盛PBS.吐温缓冲液流水冲洗载片1s，然后立即将其浸人装有PBS吐温缓冲液的洗杯中浸泡至少5 min。有条件的情况下可用旋转摇床进行振荡。6.1.5加样滴加20μLFITC标记的抗人IgG或IgM(荧光二抗)至洁净加样板的反应区，完全加完所有的荧光二抗方可进行下一步温育。建议使用连续加样器。FITC标记的抗人IgG或IgM使用前需混勾。为节约时间，可在第一次温育的同时滴加二抗至另一个加样板的反应区。6. 1.6 温育从洗杯中取出一张载片，5s内用吸水纸擦去背面和边缘的水分后，立即盖在加样板的凹槽里。注意：为防止破坏基质，不要擦拭反应区的间隙。确保生物薄片与液滴接触良好，然后继续下一张。室温（18℃～25℃）温育30min，注意避免阳光直射载片。6.1.7 冲洗用烧杯盛PBS吐温缓冲液流水冲洗载片1s，然后立即将其浸人装有PBS吐温缓冲液的洗杯中浸洗至少5min。有条件的情况下可用旋转摇床进行振荡。可在每150mLPBS吐温缓冲液中加10滴伊文斯蓝作为衬染。6.1.8封片将盖玻片直接放在泡沫板的凹槽里。滴加甘油-PBS至盖玻片