WST 66-1996全血胆碱酯酶活性的分光光度测定方法 羟胺三氯化铁法.pdf

中华人民共和国卫生行业标准全血胆碱酯酶活性的分光光度测定方法WS/T 66-1996羟胺三氯化铁法Blood--Determinatoin of cholinesterase activitySpectrophotometricmethod--Hydroxylamine-ferric chloride method1主题内容与适用范围本标准规定了血中胆碱酯酶活性的分光光度测定方法羟胺三氯化铁法。本法最低检测浓度为2.4μmol/L。本标准适用于正常人和接触有机磷农药人员血中胆碱酯酶活性的测定。2原理血液胆碱酯酶使乙酰胆碱分解为胆碱和乙酸。未被胆碱酯酶水解而剩余的乙酰胆碱与碱性羟胺反应，生成乙酰羟胺，然后，与三氯化铁在酸性溶液中反应，形成红色羟酸铁络合物。颜色深度与剩余乙酰胆碱的量成正比。在波长520nm比色定量，由水解的乙酰胆碱的量计算胆碱酯酶活性。3仪器3.1分光光度计，10mm比色杯。3.2比色管，10mL。3.3普通漏斗，40mm。3.4恒温水浴箱，控温士0.5℃。3.5采血针头。3.6血色素吸管，有20μL刻度。4试剂本标准所用试剂均为分析纯试剂。4.1实验用水，蒸馏水或具同等纯度的去离子水。4.2 盐酸,P2o=1.19 g/mL。4.3盐酸溶液（1十2）。4.4碱性羟胺溶液，临用前将139g/L盐酸羟胺溶液和140g/L氢氧化钠溶液等体积混合。4.5磷酸盐缓冲液（pH=7.20)，准确称取磷酸氢二钠(Na2HPO。·12H,O)8.36g和磷酸二氢钾(KH,PO4)1.36g，用水溶解并稀释到500mL，保存在冰箱内。4.6三氯化铁溶液，称取10g三氯化铁（FeCl3·6Hz0），加0.84mL盐酸（4.2），然后加水100mL。贮存于棕色瓶中。4.7氯化乙酰胆碱标准液，精确称取乙酰胆碱1.2716g，用磷酸盐缓冲液（4.5）溶解，并稀释到100mL，此溶液1mL相当于70μmol乙酰胆碱，为贮备液。临用前，取此溶液用磷酸盐缓冲液（4.5）稀中华人民共和国卫生部1996-10-14批准1997-05-01实施 WS/T 66-1996释10倍，此溶液1mL相当于7μmol乙酰胆碱，为应用液。5采样、运输和保存5.1用血色素吸管，取耳垂血20μL，注入比色管中（事先加入0.98mL磷酸盐缓冲液），立即进行测定。5.2如不能立即测定，可静脉取血0.5mL，注入玻璃管中（含肝素或草酸钾抗凝剂），混匀。于保温瓶中加冰运送，置于4℃冰箱中可保存一周。6分析步骤样品测定按下表进行。全血胆碱酯酶测定操作步骤样品管对照管标准管空白管1. 01. 00. 980.98磷酸盐缓冲液，mL0. 020. 02混匀全血（草酸钾抗凝），mL置37C水浴中预热5min1. 01. 0乙酰胆碱应用液（4.7），mL1. 01. 0水,mL置37C水浴中反应30min，准时取出，各管加入4.0mL碱性羟胺溶液（4.4)，充分振摇2min，继续加入2.0mL盐酸溶液（4.3），充分振摇2min，再加入2.0mL三氯化铁溶液（4.4），充分振摇，用滤纸过滤后，以试剂空白为参比在波长520nm处测吸光度。然后按7.1计算胆碱酯酶活性。如同时分析大批样品，可采用标准曲线法按7.2求出胆碱酯酶活性绝对值。7 计算7.1公式计算法7.1.1按式(1)计算酶活性的绝对值。X.=C+B-A×7(1 )C一水解乙酰胆碱的浓度，μmol(0.02mL·37℃·30min）；式中：X--A——-以试剂空白为参比的在波长520nm处样品管的吸光度值；B—-以试剂空白为参比的在波长520nm处对照管的吸光度值；C以试剂空白为参比的在波长520nm处标准管的吸光度值。7.1.2按式(2)计算酶活性的相对值。F× 100·(2)式中：Y一酶活性的相对值，%；X，—被测血样中酶活性的绝对值，μmol(0.02mL·37C·30min)；X。—正常人血中酶活性绝对值，μmol(0.02mL·37℃·30min）。7.2标准曲线法7.2.1被水解乙酰胆碱的吸光度=C-（A一B）。 WS/T 66-19967.2.2被水解乙酰胆碱的吸光度查乙酰胆碱标准曲线，得相应的被水解乙酰胆碱（umol）。此值是0.02mL血液在37℃30min反应条件下，胆碱酯酶的活性绝对值。8说明8.1本法检测限为2.4μmol/L，线性范围为2.4～1000.0μmol/L。当乙酰胆碱的含量为1.4，4.2，7.0μmol时，其变异系数分别为：12.8%，9.0%，6.4%。8.2使用的玻璃器皿洗净后，在1十3硝酸中浸泡24h，用水冲洗干净后，再用蒸馏水洗三次，干燥后备用。8.3取血时不应过度挤压耳垂，因为本法是同时测定血清假性胆碱酯酶和血球真性胆碱酯酶。选用的乙酰胆碱基质浓度对血球真性胆碱最适宜，此时测