SN_T 3431-2012香蕉坏死条纹病菌检疫鉴定方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3431—2012香蕉坏死条纹病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Xanthomonas arboricolapv. celebensis(Gaumann)Vauterin et al.2012-12-12 发布2013-07-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3431-2012前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国海南出人境检验检疫局。本标准主要起草人：刘福秀、韩玉春、徐卫、李伟东、林明光。I SN/T 3431—2012香蕉坏死条纹病菌检疫鉴定方法1范围本标准规定了出人境植物检疫中香蕉坏死条纹病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于香蕉鲜果、种苗和其他寄主植物材料中香蕉坏死条纹病菌的检疫鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。一凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所肴的修改单)适用于本文件。GB/T4789.28—2003食品卫生微生物学检验‘染色法、培养基和试剂3病菌基本信息pv. celebensis (Gaumann 1923 ), Vauterin, Hoste, Kersters 学名: Xanthomonas arboricolpSwings 1995.异名 :Xanthomonas cam pestris pv. celebensis Dye1g78pv. celebensi:Xanthomonas aronopodis p中文名：树生黄单胞菌柳叶致病变种英文名称:Banana leaf stripes香蕉坏死条纹病菌属原核生物界Procaryotes、变形细菌门roteobacteria、-变形细菌纲Gamma-proteobacteria、黄色单胞菌目Xanthomionadalds、黄色禅胞菌科Xanthomonadaceae、黄色单胞菌属Xanthomonas、树生黄单胞菌 Xanthomonas arboricola 该病菌主要通过带菌种苗、鲜果和病株的残枝落叶进行远距离传播。4原理该病害症状、病菌生物学特性(参见附录 A)、生理生化特性和致病性测试是该病菌检测鉴定的依据。5仪器设备和用具5.1仪器设备电子天平（0.001g）、实体显微镜、超净工作台、温控培养箱、高压灭菌锅、微生物自动鉴定系统、PCR仪、电泳仪、紫外检测仪或凝胶成像系统、离心机、恒温水浴锅（30℃～95℃）、超低温冰箱、普通冰箱、纯水机、涡旋振荡器、可调微量加样器等。5.2用具解剖刀、裁纸刀、量筒、烧杯、培养Ⅲ、三角瓶、离心管、放大镜、手术剪、镊子、接种环等。 SN/T 3431--20126 化学试剂6.1试剂次氯酸钠（NaCIO）、磷酸二氢钠（NaH2PO.）、70%乙醇、吐温-60、吐温-80、淀粉、蔗糖、葡萄糖、果糖、海藻糖。6.2 培养基YDC培养基、GYCA培养基和YPGA培养基，各培养基配方及配制方法见附录B。７ 检测鉴定7.1现场检疫7. 1.1 感官检查仔细检查，观察典型症状或可疑症状（参见附录 A）。感病组织表面可能有菌脓。7.1.2样品抽取发现可疑植株，切取受害部位或将整棵植株取回实验室检验。7.2室内检测与鉴定7.2.1病原菌分离纯化取(1 mm～2 mm)X（2 mm～4 mm)病组织,用无菌水冲洗后放人0.5ml～2.0 ml.无菌水中,观察是否有细菌溢出。如果有喷菌现象，则用接种环挑取喷出的菌液，YDC培养基上划线分离。如没有喷菌现象，则在经过高压灭菌的研钵中加人3mLSPS缓冲液，用灭菌玻棒将病组织研碎，在室温下浸泡15min，取100μL组织悬浮液在YDC培养基上划线分离。看不到症状的情况下，用无菌水洗涤病组织，洗涤液在YDC培养基上划线分离。划线细菌在25℃～28℃下培养3d～4d后即可观察所产生的菌落。如果发现可疑的菌落应该及时使用YPGA或GYCA培养基再进行1～2次的纯化培养，最后获得纯菌株。7.2.2形态观察病菌为革兰氏阴性,菌体短杆状,大小(0.3μm～0.4 μm)×（1.1 μm～l.2 μm），多数单个排列，少数3～4个连接成短链。不产生芽孢，无荚膜。鞭毛单根极生。在YDC培养基上生长的菌落呈灰白色到奶油色，隆起，光滑，有光泽，边缘整齐，培养2d菌落直径可达1 mm。开始时菌落透明，渐渐混浊不透明，最后变成表面有一层粘质的固体物。在 YPGA或 GYCA 平板上恒温（25℃～28℃)培养5 d,菌落突起，表面光滑，乳白色，有光泽，菌落