SNT 2530-2010贝类、果蔬和水样中脊髓灰质炎病毒检测方法 普通RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2530—2010贝类、果蔬和水样中脊髓灰质炎病毒检测方法·普通RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法Determination of polioviruses in shellfish, fruit , vegetable and water-Conventional RT-PCR and real-time RT-PCR2010-09-16实施2010-03-02 发布中华人民共和国查询真得发布、数码防伪国家质量监督检验检疫总局 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准贝类、果蔬和水样中脊髓灰质炎病毒检测方法普通RT-PCR方法和实时荧光 RT-PCR方法SN/T 2530—2010*中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码：100045网址 电话：6852394668517548中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷字数 25 千字开本 880×1230 1/16印张１反　2010年5月第一次印刷2010年5月第一版印数 1-1 600*书号：155066·2-20869 SN/T 2530-2010前言本标准中附录 A为规范性附录,附录 B为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局。本标准主要起草人：李想、潘良文、卢钟山、吕蓉、张舒亚、黄一、刘月明、高琴。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 2530—2010贝类、果蔬和水样中脊髓灰质炎病毒检测方法　普通 RT-PCR 方法和实时荧光 RT-PCR方法1范围本标准规定了贝类、果蔬和水样中脊髓灰质炎病毒普通 RT-PCR方法和实时荧光 RT-PCR方法。本标准适用于贝类、果蔬和水样中脊髓灰质炎病毒的定性检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的必威体育精装版版本。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本适用于本标准。SN/T 1193基因检验实验室技术要求3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3. 1Ct 值 cycle threshold每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。3.2质粒标准分子plasmid reference molecule一种包含病毒特异性 cDNA 片段的重组质粒分子,可作为病毒 PCR检测中的阳性对照。4方法提要用合适的裂解液(如 Tri-reagent)提取贝类样品中病毒 RNA,并根据脊髓灰质炎病毒 RNA 3末端含有 Poly(A)的结构，用连接Oligo(dT)25的磁珠特异性吸附脊髓灰质炎病毒 RNA 进行纯化。对水样中的病毒进行富集后,采用合适的方法提取和纯化病毒 RNA。用合适的缓冲液洗脱果蔬样品表面病毒后,对病毒进行富集，并采用合适的方法提取纯化病毒 RNA。利用普通 RT-PCR或实时荧光 RT-PCR方法进行检测。本研究通过构建质粒标准分子（每个质粒分子包含1拷贝扩增片段），确定适于I型、I 型、ⅡI型脊髓灰质炎病毒检测的普通 RT-PCR 体系检测下限均为 50 拷贝,实时荧光 RT-PCR 体系检测下限均为 2拷贝。5 试剂所有实验用试剂均为分析纯;除特别说明外，实验用水为蒸馏水或去离子水。5.1阳性标本:脊髓灰质炎病毒，一80℃冰箱保存;或含脊髓灰质炎病毒检测目的片段的质粒标准分子，一20℃冰箱保存。5.2甘氨酸缓冲液：见 A.1.1。5.3 PEG 8 000 溶液:见 A.1.2。5.4 PBS缓冲液:见 A.1.3。 SN/T 2530-—20105.5裂解液：Tri-reagent 或其他等效裂解液（如：TRIzol）。5.6Oligo(dT)25磁珠:Dynabeads-oligo(dT)25或等效品。5.7超纯水(无 RNase 和 DNase 污染）：见 A.2.3。5.875%乙醇:见A.2.4。5.9三氯甲烷。5.10异丙醇。1RNA吸附缓冲液:见 A.2.5。5.115. 122XRNA吸附缓冲液:见 A.2.6。5.13漂洗缓冲液：见A.2.7。PrimeScriptTM RT reagent Kit, TaKaRarCat-No-DRR037S.5.14Blend Taq-Plus DNA 聚合酶及配套缓冲液和 dNTPs,ToYoBo,Cat. No.BTQ-201。5.15Premix Ex TaqTM (Perfect5. 16[Real Time)及配套 ROX 荧光校正试剂（50X），TaKaRa,Cat.No.DRR039A.5.17引物和探针：根据表 1和表2 的序列合成