NY_T 3063-2016马铃薯抗晚疫病室内鉴定技术规程.pdf

ICS 65.020B 16NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 3063—2016马铃薯抗晚疫病室内鉴定技术规程Code of practice for evaluation of potato resistance to late blight in greenhouse2016-12-23发布2017-04-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T3063—2016前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则编写本标准由农业部种子管理局提出并归口。本标准起草单位：中国农业科学院蔬菜花卉研究所。本标准主要起草人：杨宇红、谢丙炎、冯兰香、振川、凌键、陈国华I NY/T3063—2016马铃薯抗晚疫病室内鉴定技术规程1范围本标准规定了马铃薯抗晚疫病（lateblight)）离体叶片和盆栽鉴定方法与评价标准本标准适用于马铃薯（SolanumtuberosumL.）品种和材料对晚疫病抗性的室内鉴定及评价。2术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2. 1马铃薯晚疫病potatolateblight由致病疫霉[Phytophthorainfestans（Mont.）deBary]侵染马铃薯叶片、叶柄、茎和块茎引起的一种流行性卵菌病害（病害诊断参见附录A）。3试剂与材料3.115%二甲亚(DMSO)溶液在85mL灭菌水中加人15mL二甲亚砜，混匀后贮存于4℃冰箱中。3.2抗生素母液称取2.0g氨芊青霉素、0.2g利福平、1.0g制霉菌素分别溶于少量水中，其中，利福平需先溶于少量二甲亚中，搅拌至溶解后加水定容至100mL制成3种抗生素的母液，经细菌过滤器过滤后，贮存于4℃冰箱中备用。3.3培养基3.3.1黑麦培养基黑麦粒60g、蔗糖20g、琼脂粉15g、水1000mL。先将黑麦粒用水浸泡24h～36h，用捣碎机捣碎后经3～4层纱布过滤，取浸泡水和滤液加水定容至1000mL，加入蔗糖、琼脂，加热并搅拌至琼脂完全溶化后，于（121士1)℃高压灭菌15min。3.3.2选择性黑麦培养基当100mL灭菌黑麦培养基冷却至约50℃时，加人3种抗生素母液各1mL。使培养基中氨青霉素、利福平和制霉菌素的终浓度分别为200ug/mL、20μg/mL和100μg/mL。3.3.3黑麦粒培养基在50mL离心管中加人3.3g黑麦粒和20mL水，浸泡12h后，于（121士1）℃高压灭菌15min。注意灭菌时不要将管盖完全拧紧，灭菌后再拧紧管盖备用。3.4对照材料以马铃薯底西瑞（Desiree）或“费乌瑞它（Favurit）’等感病品种为感病对照3.5育苗基质将草炭、蛭石和菜田土按体积2：1：1混合均匀，于（134士1)℃湿热灭菌1h。或直接购买商品化蔬菜育苗基质。3.6其他用品培养皿、托盘、离心管、烧杯、量筒、锥形瓶、纱布、滤纸、酒精灯、细菌过滤器、小型手持喷雾器、育苗钵等。1 NY/T3063—20164仪器设备和设施4.1显微镜放大倍率：40倍～1000倍。4.2恒温培养箱温度范围：0℃～50℃，温度波动不大于1℃。4.3高压灭菌锅灭菌温度范围：104℃～135℃，灭菌时间范围：4min～120min，最高工作压力：0.25MPa～0.22MPa。4.4移液器量程体积：2uL～20uL，系统误差：士1.2%，随机误差：士0.6%4.5电子天平称量范围：0g~1000g.分度值：0.01g。4.6捣碎机额定转速：10000r/min~12000r/min，处理量：500mL，工作方法：断续。4.7超净工作台洁净等级：100级≥0.5μm，菌落数：≤0.5个/（皿·h）（Φ90mm培养平皿），平均风速：0.25m/s~0.6m/s。4.8人工接种鉴定室具备人工调节温度、湿度及光照的条件，使人工接种后具备良好的发病环境。5鉴定方法5.1离体叶片法5.1.1材料育苗将供鉴定材料及感病对照的种薯置于15℃～20℃下催芽。待薯芽长1cm～1.5cm时，将种薯切成每块只带1个健康芽眼的薯块，芽眼朝下播于装有育苗基质的育苗钵内，每钵播种1块，置于日光温室里，温度保持在18℃～25℃，常规水肥管理，自然光照。待幼苗长到7片～10片复叶时，选择生长一致、健壮的幼苗用于抗病性鉴定。5.1.2接种体制备见附录B。5.1.3接种从植株顶部计起，取第3、4、5片展开叶，背面朝上置于双层湿润灭菌滤纸上，在每个小叶叶背主叶脉的一侧用微量移液器滴加10uL浓度为8×103个孢子囊/mL的孢子囊悬浮液。每份材料设3个重复，每重复不少于6片复叶。5.1.4接种后管理接种后将容器用保鲜膜封好，置于18℃～20℃光照培养箱内，在每日光照16h，黑暗8h，相对湿度100%条件下培养。5.1.5病情调查调查方法接种后5d～6d，以复叶的每片小叶为调查单位，测定病斑面积及观察有无孢子囊和霉层，根据表