NY_T 2679-2015甘蔗病原菌检测规程 宿根矮化病菌 环介导等温扩增检测法.pdf

ICS 65.020B 16NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 2679—2015甘蔗病原菌检测规程环介导等温扩增检测法宿根矮化病菌Detection procedures of sugarcane pathogen-Leifsonia xyli subsp.xyli-Detection method of loop-mediated isothermal amplification2015-05-01实施2015-02-09 发布中华人民共和国农业部发布 NY/T 2679—2015前創言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由农业部种植业管理司提出。本标准由全国果品标准化技术委员会（SAC/TC510)归口。本标准起草单位：福建农林大学农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室、农业部甘蔗及制品质量监督检验测试中心。本标准主要起草人：许莉萍、阙友雄、郭晋隆、吴期滨、陈如凯、周定港、罗俊、陶玲。I NY/T 2679—2015甘蔗病原菌检测规程宿根矮化病菌环介导等温扩增检测法1 范围本标准规定了环介导等温扩增技术检测甘蔗宿根矮化病菌(Leifsoniaylisubsp.ryli)的原理、试剂和材料、仪器和设备、操作步骤、结果判定与表述等技术内容。本标准适用于甘蔗组培苗、田间植株、种苗、种茎中甘蔗宿根矮化病菌的LAMP检测。2缩略语和符号2.1下列缩略语适用于本标准2.1.1 LAMP:loop-mediated isothermal amplification,环介导等温扩增。2. 1.2dNTPs Mixture:deoxyribonucleoside triphosphates mixture,脱氧核苷三磷酸混合液。2. 1. 3 ddH2O:double distilled H2O,双蒸水。2.1.4CTAB:hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵。2. 1.5 Tris:tris(hydroxymethyl)methyl aminomethane,三(羟甲基)氨基甲烷。2.1.6 EDTA:Edetate disodium,乙二胺四乙酸钠。2.1.7 LF:forward loop primer，正向环引物。2. 1.8 LB:backward loop primer,反向环引物。2.2下列符号适用于本标准2.2.1F3c在靶基因的3末端设定的一个区段。2.2.2F2c:在靶基因的3末端设定的一个区段，位于F3c的5端。2.2.3F1c:在靶基因的3末端设定的一个区段，位于F2c的5端。2.2.4B1：在靶基因的5末端设定的一个区段。2.2.5B2:在靶基因的5末端设定的一个区段，位于B1的5端。2.2.6B3:在靶基因的5末端设定的一个区段，位于B2的5端。2.2.7F3(forward outer primer)：正向外引物，含有与目标DNA上的F3c序列互补的区段。2.2.8B3(backward outer primer)：反向外引物，含有与目标 DNA上的B3 相同序列的区段。2.2.9FIP(forward inner primer)：正向内引物，在3末端含有与F2c互补的F2区段，在5末端含有与F1c相同序列的区段。2.2.10BIP(backward inner primer)：反向内引物，在3末端含有与B2c互补的B2区段，在5末端含有与B1c相同序列的区段。3原理LAMP是一种恒温核酸扩增方法。DNA在65C左右处于动态平衡状态，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离成为单链。在靶基因的3末端设定F3c、F2c、F1c3个区段，在5末端设定B1、B2、B33个区段。针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用链置换DNA聚合酶在等温（65℃左右）条件下保温一定的时间，即可完成核酸扩增反应。以感染了甘蔗宿根矮化病菌(Leifsoniarylisubsp.ryli,Lxx)的甘蔗为供试样品，提取的甘蔗总DNA里含有病原细菌的DNA，可用于检测。1 NY/T 2679—20154试剂除另有规定外，所用试剂均为分析纯。4.12XCTAB抽提缓冲液:含100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0),20 mmol/L EDTA,1. 4 mol/L NaCl,2.0%CTAB，配方见附录A。该缓冲液在121℃下热灭活20min~30min，使用前加人0.1%（V/V)的β-巯基乙醇。4.2氯仿/异戊醇(V/V)=24：1。4.3检测引物序列。4. 3. 1F3:5- ACATCGGTACGACTGGGT-3。4.3.2 B3:5- TGGCCGACCAAAAAAGGT-3。4.3.3FIP(F1c+