SN_T 3972-2014猪流感病毒病检疫技术规范.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3972--2014猪流感病毒病检疫技术规范Quarantine protocol for swine influenza disease2015-03-01实施2014-07-14 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局刮涂层查真伪 SN/T 3972-2014前言本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国广东出人境检验检疫局、广东省农业科学院动物卫生研究所。本标准主要起草人：卢体康、孙洁、张彩虹、秦智锋、曾少灵、林庆燕、宋长绪、刘建利、陈茹、陈书琨、陶虹、唐金明、陈兵、胡运发。 SN/T 3972—2014猪流感病毒病检疫技术规范1范围本标准规定了猪流感的临床诊断、病原学和血清学检疫技术要求。本标准适用于对进出境猪流感的诊断、检疫和监测。n规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682　分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出人境动物检疫采样3缩略语下列缩略语适用于本文件。pH,N（2009）：甲型H,N（2009)流感病毒SI:猪流感SIV:猪流感病毒4概述猪流感病毒一年四季均可在猪群中流行，不同品种、年龄的猪均可感染。病猪是重要传染源，康复猪可能成为长期的带毒和排毒者。本病的主要传播途径包括直接接触传播和空气传播。病猪突然发烧，体温在40.5℃～41.5℃之间，有时达42℃。病理变化主要发生在呼吸器官，鼻、喉、气管及大支气管黏膜充血、肿胀并覆有黏稠的液体，小支气管和细支气管充填渗出物，胸腔蓄积多量混有纤维素的浆液，纵膈淋巴结和支气管淋巴结肿大，肺脏的病变多发生在尖叫、心叶、中间叶及隔叶的背部和基底部，呈紫红色，坚实，塌陷，而周围的肺组织则呈苍白色气肿状态，界限分明，肺的间质增宽，并出现炎症变化，心包腔蓄积混有纤维素状的液体，胃肠黏膜呈现卡他性炎；脾脏微肿。5 病原学检测5.1病毒分离与鉴定5.1.1材料器材与设备棉拭子、剪刀、镊子、注射器、离心管、高速台式冷冻离心机、漩涡振荡器、研钵、勾浆器、微量可调移液器、冰箱、生物安全柜、照蛋器、打孔器、酒精灯、1.0 mI.一次性灭菌注射器、孵蛋器、细胞培养瓶、吸管、洗耳球或电动助吸器、二氧化碳培养箱、倒置显微镜， SN/T 3972-20试剂符合 GB/T 6682所规定的级水，胎牛血清,9～11日龄 SPF鸡胚，犬肾传代细胞，石蜡、5%碘、75%酒精，青霉素、链霉素、双抗贮存液、pH7.2,0.01mol/LPBS、细胞生长液、细胞维持液、细胞消化液等溶液（配制方法见A.1）。5.1.2样品的采集与处理一般要求样品的采集、保存及运输应符合GB/T18088的相关要求。鼻腔拭子将灭菌的棉拭子插人猪鼻腔，轻轻擦拭3～5次并慢慢旋转，然后取出拭子并放人盛有 2mI.灭菌的0.01 mol/IpH 7.2PBS(含青霉素 10 000IU/mL，链霉素 10 000μg/mL)管内，加盖、编号。肺脏组织采集新鲜的可疑病变肺脏组织约 3.0 g～4.0g,放置于无菌平Ⅲ中,编号。 血清或血浆用无菌注射器直接吸取至无菌1.5mL离心管中，编号。样品的保存和运输待检样品在2℃～8℃保存不应超过24h；一20℃保存不超过3个月；一80℃以下可长期保存。样品应置于低温、密封的容器内运输。样品制备鼻腔拭子样品于旋涡振荡器上振荡混勾约5s后，于离心机中瞬时离心待用。血清或血浆样品于台式冷冻离心机上3000r/min冷冻离心5min后取上清待用。组织样品，用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品2.0g于研钵中充分研磨，再加10mLPBS(含青霉素10000IU/mL，链霉素 10000μg/mL)混匀，或置于组织匀浆器中，加人10mL.PBS(含青霉素10000 IU/mL，链霉索10000 μg/mL)匀浆，然后将组织悬液转人无菌1.5mL离心管中3000r/min4℃离心15min,取上清液转入另-无菌1.5mL离心管中，编号备用。5.1.3病毒分离鸡胚分离病毒.1将 9～11 日龄 SPF鸡胚用照蛋器照视检查,在气室边缘上 2 mm～8 mm 处避开血管作-标记。.2将鸡胚竖放在蛋座上，钝端向上。用5%碘酊消毒蛋壳气室后，用75%的酒精脱碘消毒，用无菌处理的打孔器在标记处钻一小孔（勿损伤壳膜）。.3用1.0mL注射器吸取0.2mL处理好的样品，针头刺人孔内，经绒毛尿囊膜注人尿囊腔，如图1所示，每个样品接种5个鸡胚。.4接种后，加热熔化石蜡封孔，于35℃～37