SN_T 3580-2013四种大豆危险性真菌多重实时荧光PCR检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3580—2013四种大豆危险性真菌多重实时荧光PCR 检测方法Detection and identification of four kinds of soybean fungaldiseases with multiplex real-time PCR2013-03-01发布2013-09-16实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3580--2013前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布结构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、辽宁省农业科学研究院。本标准主要起草人：章桂明、王颖、程颖慧、郑耘、陈枝楠、缪建锟。I SN/T 3580—2013四种大豆危险性真菌多重实时荧光PCR检测方法1 范围本标准规定了大豆上的危险性真菌一一大豆疫霉病菌（Phytophthora sojae）、大豆北方茎溃疡病菌（Diaporthe phaseolorum var.caulivora）、大豆南方茎溃疡病菌（Diaporthe phaseolorum var.meridionalis)和大豆拟茎点种腐病菌（Phomopsis longicolla）的多重实时荧光PCR检测鉴定方法。本标准适用于大豆上的大豆北方茎溃疡病菌、大豆南方茎溃疡病菌和大豆拟茎点种腐病菌以及大豆夹杂的土壤等传带大豆疫霉病菌的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T 1131大豆疫霉病菌检疫鉴定方法SN/T 11933基因检验实验室技术要求SN/T 1899大豆茎溃疡病菌检疫鉴定方法3原理根据大豆疫霉病菌、大豆北方茎溃疡病菌、大豆南方茎溃疡病菌和大豆拟茎点种腐病菌的分子生物学特性，设计其各自的特异性引物和探针。探针的5标记为不同的荧光报告基团，3’端标记为荧光淬灭基团，通过寡核酸连接进行荧光谐振能量传递。在扩增反应中，由于扩增酶的5端外切酶作用将与模板匹配的探针切割，使两个基团分开，在一定激发光条件下，荧光基团发出自身波长的光，不同的荧光信号标记类型其需要的激发光条件不同，能够被收集到的荧光信号也有所不同，从而实现多重检测。4　仪器、用具及试剂4.1仪器及用具烘箱、高压灭菌锅、天平（感量1/100，1/10000）、研钵、摇床、水浴锅、制冰机、纯水机、旋涡振荡机、台式离心机、高速冷冻离心机、真空抽干机、冰箱、超净工作台、实时荧光PCR仪、微量移液器（0.5μL，2 μL,10 μL,20 μL,100 μL,200 μL,1 000 μL)、离心管(0. 2 mL,1. 5 mL,2. 0 mL)、Tip 头(0. 1 μL~10 μL,5 μL~200 μL,100 μL~1 000 μL)。4.2试剂PDA培养基、V8培养基、水琼脂培养基、实时荧光PCR反应缓冲液、CTAB提取缓冲液、Tris 饱和酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、无水乙醇、RNA酶、液氮。1 SN/T 3580—20135 病原菌分离培养大豆疫霉病菌的分离按照SN/T1131进行，大豆南、北方茎溃疡病菌的分离按照SN/T1899进行；其他病菌可通过对病残体进行保湿培养、土壤选择性培养等方法，分离病原真菌。多重实时荧光PCR检测66.1核酸的制备制备步骤如下：取适量菌丝，加液氮研磨，置了2iml的离心管中，迅速加人1.5mL预热的CTAB抽提液，a）在65℃水浴锅中水浴30|min:期间不晰振荡，16000g离心15min；取上清液，加人RNaseA酶解（终浓度为10mg/L），37℃水浴30 min，加人等体积Tris 饱和b）酚，充分混匀，16000g离心15min；取上清液，加人等体积的三氮甲烷养戊醇（24：1)混匀，16000g离心15min;重复1次；c）d）取上清液，加人等体积的异丙醇（预冷），反复混匀，4℃的冰箱中静置30min，16000g离心：小心弃去上清液，加人70%乙醇500L，-000-号离心-3-min，去上清液；重复2次；）得到DNA沉淀用冷冻干仪干燥：燥后加人50L～1004I.的去离子水充分溶解，20℃f）冰箱中保存。注：也可采用DNA提取试剂盒提取梓品-DNA6.2实时荧光 PCR 检测6.2. 1引物及探针序列引物及探针序列见表1。物及探针序列}表 1就物震探得序列（5P病原菌名称产物片段大小/bpPS-F: TGOAGACGCCAGACG