LY_T 2906-2017美国白蛾核型多角体病毒杀虫剂.pdf

ICS 65.100B 65LY中华人民共和国林业行业标准LY/T 2906—2017美国自蛾核型多角体病毒杀虫剂Hyphantria cunea nucleopolyhedrovirus insecticide2017-10-27发布2018-01-01实施国家林业和草原局发布 LY/T 2906—2017目次前言范围2规范性引用文件3术语和定义3.1美国白缺核型多角体病毒杀虫剂3.2毒力3.3蓄落产品指标4.1母药4.2制剂检测方法5.1采样5.2仪器设备、耗材5,3定性检测5.4定量检测5.5外观5.6水分5.7细度5.8pH值5.9温润时间5,10悬浮率5.11分散性：5.12持久起泡性量5.13菌落总数5.14热忙稳定性验收、标志、标签、贮运、保质期6.1验收6.2标志、标签、包装6.3忙运6.4保质期附录A（规范性附录)关国白龈核型多角体病毒生物学特征附录B（资料性附录）仅器设备及耗材目录附录C(资料性附录)美国白费核型多角体病毒杀要剂产品定性检测方法附录D(资料性附录)美国白缺核型多角体病毒杀虫剂产品定量检测方法10 LY/T 2906—2017附录C（资料性附录）美国白载核型多角体病毒杀虫剂产晶定性检测方法C.1限制性内切醇法C.1.1方法概述提取样品病毒DNA，利用限制性核酸内切酶切割病毒DNA，以踪脂糖凝胶电冰分高比较标准样C,1.2病毒DNA的提取取待测样晶游于适量蒸馏水中，500r/min离心去掉沉淀和填充物等残渣，经1000r/min与3000r/min反复差速离心后，将得到的HcNPV沉淀物用无菌燕馏水悬浮，并置于等体积的40%（质量浓度）点糖落液10000r/min高心30min。用无菌蒸缩水悬浮沉淀物，经4000r/min高心数次，洗去蔗薪，再置于等体积的60%（质量浓度）薪落减上，8000r/min高心30min。取上层HcNPV带并经多次离心洗去蔗糖后，将纯化后的HcNPV多角体悬浮于无菌蒸馏水中，放至4C备用，取纯化的HcNPV病毒多角体悬液，高心沉淀后溶手适量TE(pH8.0)缓冲液，加人等体积碱解液于37C裂解1h~2h，加SDS和蛋白酶K至终浓度分别为1%（质量浓度）和200μg/mL，37C裂解2h，加人1mol/L的HCI至溶液pH值为7;分别用等体积的苯酚和氯仿反复抽提至界面无可见蛋白，然后加人2倍体积的无水乙醇于一20C沉淀2h，DNA高心沉淀后用70%乙醇洗涤1次～2次，待残余乙醇发后溶于适量TE中，至4℃备用。C.1.3将HcNPV病毒的标品和样品DNA分别与EcoRI、HindⅢ、XbaI、BamHI、PstI和PruI限制性内切酶于37C中进行水解反应5h，以3μL10XLoadingBuffer终止反应，加5μL电泳上样缓冲液，于0.8%琼脂糖凝胶中进行水平电泳。上样冲减中加人核酸染料进行DNA染色反应，在凝胶成像系统中观察比较电泳谱带，其酶切图谱应完全一致，C.2PCR扩增法C.2.1方法概述提取病毒样品DNA，设计针对HcNPV的特异性引物进行PCR扩增，以源脂糖凝胶电冰分离PCR产物，通过与标准品比较达到定性检测的目的，C.2.2病害DNA制各制备方法同C.1.2.C.2.3扩增引物设计pe38基因在不同的昆虫病毒中具有极高的特异性，且该基因仅在少数几种昆虫病毒中存在；根据该基因的特异性序列设计2对引物用于HcNPV的定性检测。8 LY/T 2906—2017P,-F,5ATG TCT AAC AGA TAT CAT CCG T 3,P,-R:5° TTT TGT CTT CAA TCA TCATGT C 3′;P,-F,5ACT TGT GCT GTG TGC TTG 3′,P,-R;5GAT TTG TCC AGT TGT GCT TG3，其中引物P:和P扩增DNA片段994bp，引物P,和P，扩增DNA片段614bp。C.2.4病毒的PCR检测以HeNPV的基因组DNA为模板扩增pe38基因的目标片段，采用20μL扩增体系dNTPMixture(2.5 mmol/L)1.5 μL,Taq(2.5 U/μL)0.5 μL,10XTaq Buffer 2 μL,上下游引物(10 μmol/L)和灭双蒸水分别微阳性和阴性对照。PCR反应参数为：94C预变性3min;94C变性30s,58C退火30s，72C延伸1min，35个循环；72C延伸7min。用1%琼脂糖检测PCR结果，溴化乙锭染色后，利用凝胶成像系统观察电泳带及其位置，与核酸分子量标准比较，确定PCR产物大小，并与HcNPV标准品PCR产物做比较，若样品PCR结果中含有与预期大小相符的片段，则视为阳性结果，否则为阴性。如果朗性对照也能扩增获得大小相同的片段，则此次检测结果无效。 LY/T 2