DB64 537_2009脱毒草莓种苗病毒分子检测技术规程.pdf

DB64宁夏回族自治区地方标准DB64/T 5372009脱毒草莓种苗病毒分子检测技术规程2009-01-07发布2009-01-07实施宁夏回族自治区质量技术监督局发布 DB64/T 5372009目次日次前言II1范围.2规范性引用文件术语和定义检测对象检测方法检测规则。附录A附录B DB64/T 5372009前本标准参照农业部行业标准NY/T406《脱毒草莓种苗病毒检测技术规程》所规定的检测对象而确定，与其区别一本标准引进了内标物，排除了假阳性，使检测体系更为科学。本标准附录A、附录B为资料性附录，本标准由宁夏农林科学院提出，本标准由宁夏农牧厅归口。本标准主要起草单位：宁夏农业生物技术重点实验室，本标准主要起草人：宋玉霞、陈晓军、刘宝山、马洪爱、王敬东、陈虞超、甘晓燕、李苗。II DB64/T 537—2009脱毒草莓种苗病毒分子检测技术规程1范围本标准规定了脱毒草莓种苗的病毒分子检测方法和操作规程。本标准适用于脱毒草莓组培苗、脱毒草莓原原种苗、脱毒草莓原种苗及脱毒草莓生产苗的病毒检测。规范性引用文件下列文件中的条款通过本规范的引用而成为本规范的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本规范，然而，鼓励根据本规范达成协议的各方研究可使用这些文件的必威体育精装版版本。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本适用于本规范，GB/T2828.1计数抽样检验程序第1部分：按接受质量水平（AQL）检索的逐批检验抽样计划。3术语和定义下列术语和定义适用于本标准，3.1脱毒草莓组培苗经组织培养脱毒处理或直接引进，经检测后确认不携带草莓斑驳病毒、草毒镶脉病毒、草莓皱缩病毒、草莓轻型黄边病毒的种苗。3.2脱毒草莓原原种苗指将草莓脱毒组培（瓶）苗移裁于无草莓病源、虫源的隔离区成活的植株。3.3脱毒草毒原种苗指由草莓脱毒原原种苗卸驾茎繁殖的植株3.4脱毒生产用苗指由草莓脱毒原种苗匍富茎紧殖用于生产草莓的植株，3.5病毒病株允许率指脱毒草莓母本株及种苗繁殖田中病毒病株的允许比率。3.6脱毒率指不携带本标准规定检测病毒的植株数占所检测植株总数的百分比，3. 7 AQL接收质量水平限（ACCEPTANCEQUALITYLIMIT）的缩写。即当一个连续系列批次被提交验收时，可允许的最差过程平均质量水平。3. 8 S4是计数抽样检验程序中设置的特殊检验水平之。GB／T2828.1设置了七个检验水平，由“低”到“高”依次为特殊检验水平S—1，S—2，S—3，S-—4和—般检验水平I、II、IⅢI.I、U、n三种水平涉及的样本量的比例大约是1：2.5：4。1 DB64/T测对象4.1草莓轻黄边病毒(Strawberrymi/d ye//owedge-associated virus，SMYEV)弱毒株系侵染，幼叶产生褐绿斑驳，叶片边缘失嫌或卷曲杯状，植株长势衰退或矮化：强毒株系侵染，幼叶反卷，产生褐绿黄斑，成熟叶片产生坏死条斑或叶脉坏死、扭曲，致整个叶片枯死。4.2草莓斑驳病毒(Strawberrymott/evirus，SMoV)弱毒株系侵染，病株叶片出现黄白色，不整齐褐色斑驳；强毒株系侵染，病株矮化，叶片变小，扭曲，量丛族状，叶脉透明，脉序混乱，在林丛草莓EMC上发病较重，初发冲击波状，通带是叶片卷曲，幼叶生长不对称，褪绿。弱毒株系可致数片小叶死亡，但前期仅叶柄变红，慢性症状包括弱毒株系在叶片上产生揭绿斑，叶脉轻微透明，叶片皱缩及扭曲：强毒株系导致植株生长衰退、矮化，叶片变小，4.3草莓皱缩病毒(Strawberrycr/nk/evirus,SCrV)主要表现为叶片上产生褪绿斑，叶片大小不等，扭曲变形，叶柄上产生褐色或黑色坏死斑，在花解上产生暗条纹或黑色坏死条斑。4.4草莓镶脉病毒(Straaberry ve/n banding virus,SVBV)主要表现有卷叶、镶脉及坏死。卷叶症状为小叶向胃面反卷，植株矮化。镶脉症状为发病初期病叶沿主脉及次脉产生绿条斑，之后形成黄色条班，坏死症状为发生在成熟叶片上，网脉变黑或坏死，脉间组织视绿或坏死，后期部分或全部枯死。检测方法本规程采用分子生物学PCR（聚合酶链式反应）扩增法进行病毒检测。5.1内标扩增为了确定提取RNA（核糖核酸）的质量，设计草毒肌动蛋白基因为内对照，利用引物（上游引物5’GCTGGGTTTGCTGGAGATG3和下游引物（5CACGATTAGCCTTGGGATTC—3）扩增可得295bp的片段，则可判定基因质量良好。5.2草莓轻黄边病毒(SMYEV)检测草莓轻型黄边病毒（SMYEV）是一种单链线形正义RNA病毒，取各编号株的叶片，提取总RNA，反转录为cDNA后进行PCR检测，利用内标引物与特异性引物（上游引物5-GTGTGCTC