一、植物病原真菌的分离培养及纯化技术.pptVIP

各种真菌病害发生的部位和症状不同，其分离要根据具体情况，采用不同的方法，下面介绍几种典型材料的分离法。 4.1.1 斑点病病原真菌的分离 4.1.2 维管束组织内病原真菌的分离 4.1.3 根腐病菌的分离 4.1.4 肉质组织中病菌的分离 4.1.5 种子内病菌的分离法 * 当前第31页\共有60页\编于星期三\19点 4.1.1 斑点病病原真菌的分离 从病斑切取每边约3-5mm的小块病组织，用70%的酒精浸几秒钟，再在0.1%的酸性升汞水溶液中浸3-5分钟；而后用灭菌水换洗3次，将其移置在琼脂培养基平板上培养。 * 当前第32页\共有60页\编于星期三\19点 4.1.2 维管束组织内病原真菌的分离 * 当前第33页\共有60页\编于星期三\19点 从根茎维管束组织分离病菌，可先将寄主病部表面用70％酒精擦拭消毒，将表皮组织用灭菌的解剖刀削去，然后切取其中小块变色的维管束组织，用升汞或漂白粉液消毒后，用灭菌水冲洗几次，移置培养基面上。 * 当前第34页\共有60页\编于星期三\19点 4.1.3 根腐病菌的分离 根腐或基腐病菌的分离，由材料的大小决定。 材料小的可以仿照斑点病的分离法。 材料大的则可采用维管束组织内病原真菌的分离法。 * 当前第35页\共有60页\编于星期三\19点 4.1.4 肉质组织中病菌的分离 多肉的茎、根和果实等，可以采用维管束组织内病菌的分离法，除去表面组织，切到其中小块病组织分离。 如有杂菌感染可采用“直接接种”法，待出现症状后，用此法再行分离。 * 当前第36页\共有60页\编于星期三\19点 * 当前第37页\共有60页\编于星期三\19点 种子如在未破裂的果荚内，可以不经过表面消毒，在无菌的条件下取出移在培养基平板上培养。 4.1.5 种子内病菌的分离法 将整粒的种子或种子的一部分进行表面消毒（升汞或漂白粉），用灭菌水洗涤后移在琼脂培养基平板上培养。 * 当前第38页\共有60页\编于星期三\19点 稀释法是微生物学上最早使用的分离法，主要用于分离细菌和酵母菌等。 4.2 稀释分离法 植物病原真菌的分离一般很少用稀释法分离，但有些产生大量孢子的病原真菌和霉菌，可以配成孢子悬浮液稀释分离。 * 当前第39页\共有60页\编于星期三\19点 方法： 用无菌水从发病组织表面冲下孢子，配成孢子悬浮液， 用无菌移液管或滴管吸取一定体积的菌液至平板培养基上， 然后用无菌玻璃棒将菌液轻轻的均匀涂布在整个平板上，或将菌液移至无菌培养皿中，然后倾入融化后冷却至45℃的培养基， 轻轻振荡、平置、凝固后倒置培养。 * 当前第40页\共有60页\编于星期三\19点 4.2.1 孢子分离法 产生大量孢子的病菌如青霉属(Penicillium)、交链孢属(Alternaria)、小丛壳属(Glomerella)、拟茎点霉属(Phomopsis)及茎点属(Phoma)等，则可配制成孢子悬浮液,以稀释法或划线法分离。 * 当前第41页\共有60页\编于星期三\19点 许多真菌的孢子在成熟时有弹射的作用，这样就可以将产生孢子的材料，放在琼脂培养基平板的下面或者悬挂在上面，便孢子弹射在培养基上而得到纯培养。 * 当前第42页\共有60页\编于星期三\19点 典型的是担子菌亚门大型真菌担孢子的分离和获得： 担孢子无色或有色，浅色的担孢子需要成团堆积时方能辨识，一般是依靠“孢子印”。 * 当前第43页\共有60页\编于星期三\19点 为了研究一些真菌在土壤中存活和分布的情形，从有病的土壤中分离它们是必要的。 分离方法是将土壤取出少许，配制成悬浮液，然后用稀释法或划线法分离。 4.2.2 土壤带菌分离法? * 当前第44页\共有60页\编于星期三\19点 1）材料： 马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1000ml 1、马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基 马铃薯葡萄糖琼脂：potato dextrose agar, 简称PDA；马铃薯蔗糖琼脂： potato sucrose agar, 简称PSA。 一、真菌学研究中常见的培养基的制作和灭菌 * 当前第1页\共有60页\编于星期三\19点 * 当前第2页\共有60页\编于星期三\19点 2）制作步骤 马铃薯洗净，去皮称200g切块/条， 1000ml水煮沸30min， 用双层纱布滤去薯块， 加入15-20g琼脂，加热熔化，再加20g葡萄糖， 待完全溶解后，趁热用双层纱布再过滤， 补水并定容到1000ml,分装于三角瓶或试管中， 塞好棉塞并包上牛皮纸，扎紧后高压灭菌。 * 当前第3页\共有60页\编于星期三\19点 自然pH； 调pH值， 也可用1mol/L的NaOH或HCl调至pH