间接免疫荧光法.pptxVIP

第1页/共13页间接免疫荧光法第2页/共13页间接免疫荧光 第3页/共13页外周血单个核细胞分离 ----- 葡蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法 [原理] 外周血单个核细胞（PBMC）包括淋巴细胞、单核细胞，其体积、形状和比重与其他细胞不同。红细胞和多核细胞比重较大，为1.092左右，而淋巴细胞和单核细胞比重为1.075左右。利用比重为1.077左右的分层液作密度梯度离心，使一定比重的细胞按密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。第4页/共13页 [材料] 1、淋巴细胞分层液（葡蔗糖-泛影葡胺，比重为1.077±0.001g/L） 2、 2％台盼蓝染液 3、 Hank’s液或者RPMI-1640培养基 4、试管、吸管、水平离心机等第5页/共13页[方法]1、无菌采集静脉血2ml注入盛有2ml Hank’s液（含100u/ml肝素）的试管中，混匀。2、吸取淋巴细胞分层液2ml加入离心管中，再将稀释抗凝血液小心沿管壁加至分层液上，应注意保持两者界面清晰。（关键）3、室温2000r／min离心20min。管内可分为四层。第6页/共13页第7页/共13页4、用毛细吸管轻轻吸出乳白色的单个核细胞，加入另一支已含有2~5 mlHank’s液的离心管中，混匀。5、室温下，1500 rpm离心10 min。6、弃上清，将PBMC用1ml PBS稀释，混匀 第8页/共13页间接免疫荧光检测人外周血单个核细胞第9页/共13页First antibodysecondary antibody-fluorochromePBMCTarget cells原 理第10页/共13页材 料PBMC兔抗人白细胞血清 (Ab1)FITC-抗兔单克隆抗体 (Ab2)第11页/共13页方 法吸管取1滴PBMC液体（约10ul）滴加到标本片黑色圈圈背面中央, 静止5-10分钟，待PBMC干燥。 15 ml Ab1 加入玻片上湿盒内孵育 30min。甩干玻片, 用洗脱液洗5次，甩干玻片玻片上加15 ml 荧光二抗 (Ab2) 湿盒内孵育 30min。(避光操作)甩干玻片, 用洗脱液洗5次，甩干玻片用荧光显微镜观察结果第12页/共13页RESULTS第13页/共13页谢谢观看！