第六章克隆基因的表达.pptVIP

由体外重组产生的DNA分子，通过转化、转染、转导等适当途径引入宿主会得到大量的重组体细胞或噬菌体。面对这些大量的克隆群体，需要采用特殊的方法才能筛选出可能含有目的基因的重组体克隆。同时也需要用某种方法检测从这些克隆中提取的质粒或噬菌体DNA，看其是否确实具有一个插人的外源DNA片段。 目前已经发展和应用了一系列构思巧妙、可靠性较高的重组体克隆检测法，包括使用特异性探针的核酸杂交法、免疫化学法、遗传检测法和物理检测法等。 第三十页，共四十七页，2022年，8月28日 一、遗传检测法 遗传检测法可分为根据载体表型特征和根据插入序列的表型特征选择重组子两种方法。 1．根据载体表型特征选择重组体分子的直接选择法 在基因工程中使用的所有的载体分子，都带有一个可选择的遗传标记或表型特征。质粒以及柯斯载体具有抗药性标记或营养标记，而对于噬菌体来说，噬菌斑的形成则是它们的自我选择特征。 第三十一页，共四十七页，2022年，8月28日 (1) 抗药性标记插入失活选择法 pBR322质粒是DNA分子克隆中最常用的一种载体分子。编码有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。只要将转化的细胞培养在含有四环素或氨苄青霉素的生长培养基中，便可以容易地检测出获得了此种质粒的转化子细胞。 第三十二页，共四十七页，2022年，8月28日 重组菌 非重组菌 非重组菌 不含有抗菌素的 培养基 含有抗菌素的 培养基 含有抗菌素的 培养基 第三十三页，共四十七页，2022年，8月28日 第一页，共四十七页，2022年，8月28日 一、 真核细胞基因克隆载体 1．在酵母细胞中克隆基因常用的载体 酵母是研究真核生物DNA的复制、重组、基因表达以及调控过程等的理想材料，为此，也构建了许多人工质粒载体。 根据这些质粒和复制方式不同，把它们分为整合型(YIp)、复制型(YRp)、附加体型(YEp)等。 第二页，共四十七页，2022年，8月28日 以上3种类型载体的共同特点是： ① 能在大肠杆菌中克隆，并且具有较高的拷贝数。这样可使外源基因转化到酵母细胞之前先在大肠杆菌中扩增； ② 含有在酵母细胞中便于选择的遗传标记。这些标记一般能和大肠杆菌相应的突变体互补。有些还携带有用于大肠杆菌的抗生素抗性标记； ③ 含有合适的限制酶切割位点，以便外源基因的插入。 第三页，共四十七页，2022年，8月28日 (1) 整合型载体(YIp) YIp型载体是由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片段构成的，如PYeleul0是由Co1E1质粒和酵母DNA提供的亮氨酸(Leu2+)片段构成。由于leu 2+基因片段不含自主复制起始区，只作为选择标记，所以YIp型载体在酵母细胞中不能自主复制。YIp型载体可经转化作用导入受体细胞，进入细胞后的YIp质粒DNA通过与受体染色体DNA的同源重组，被整合到染色体上，并随染色体一起复制。这样质粒DNA以单拷贝基因形式稳定地遗传。 第四页，共四十七页，2022年，8月28日 (2)复制型载体(YRp) YRp型载体是酵母的DNA片段插入到大肠杆菌质粒中构成的。其中酵母DNA片段不但提供了选择标记，还携带来自酵母染色体DNA的自主复制顺序(ARS)。 因为它同时含有大肠杆菌和酵母的自主复制基因，所以能在两种细胞中存在和复制。可以在两种截然不同的生物细胞中复制的载体称为穿梭载体(shuttle vector)。穿梭载体在基因工程中广泛使用。 第五页，共四十七页，2022年，8月28日 (3) 附加体型载体(YEp) YEp型载体一般由大肠杆菌质粒、2um质粒以及酵母染色体的选择标记构成。2um质粒是酿酒酵母含有一个长度为2um的内源质粒，它的DNA分子通常与蛋白质结合构成复合物，存在于核区。2um质粒含有自主复制起始区(ori)和STB区，STB序列能够使质粒在供体细胞中维持稳定。利用2um质粒，人们已经构建出许多YEp型载体。 第六页，共四十七页，2022年，8月28日 2．植物基因克隆的载体——Ti质粒 Ti质粒存在于能够引起植物形成冠瘿瘤的土壤农癌杆菌中。这种肿瘤的形成是由Ti质粒决定的，故称为诱导肿瘤的质粒(tumor inducing plasmid)，简称Ti质粒。 第七页，共四十七页，2022年，8月28日 (1) 冠瘿瘤 在Ti质粒诱导的肿瘤细胞中，具有大量的不正常的氨基酸类物质——冠瘿碱(opine)，这是一类相对分子质量较小的碱性氨基酸衍生物，由Ti质粒DNA编码。正常植物细胞不能合成和利用