蛋白质组学方法研究TPx在肝风内动证中的表达及关系（职称论文资料）.docVIP

蛋白质组学方法研究TPx在肝风内动证中的表达及关系（职称论文资料） 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：蛋白质组学方法研究TPx在肝风内动证中的表达及关系 1 1对象与方法 2 二维电泳和图像分析 2 二维凝胶电泳图像分析 3 文2：应用蛋白质组学方法研究大肠癌分化相关蛋白 5 0 引言 6 1 材料与方法 7 2 结果 8 3 讨论 9 参考文摘引言： 10 原创性声明（模板） 12 文章致谢（模板） 12 正文 蛋白质组学方法研究TPx在肝风内动证中的表达及关系（职称论文资料） 文1：蛋白质组学方法研究TPx在肝风内动证中的表达及关系 中医“证”实质研究为中医基础理论研究的基石，目前，“证”实质的研究主要采用现代医学的方法，寻找“证”的客观指标，用微观指标去认识“证”。肝风内动证属内风。《素问?至真要大论》说：“诸风掉眩， 皆属于肝”； 本证的根本病机是肝阴(血)不足、肝肾阴液亏耗， 阴不制阳、肝阳升动无制； 因造成肝肾阴亏的病因不同，临床表现为肝阳化风、阴虚风动、血虚生风三亚型虽三者的临床表现各异，但同属于中医内风证，因而有共同的物质基础。蛋白质组学从人体整体的蛋白质，从蛋白质组基础上进行研究，能全面反应“证”变化的物质基础。本实验利用蛋白质组学三大核心技术：双向凝胶电泳技术(Two Dimeional Gel Electrophoresis， 2DE)，生物质谱鉴定技术(Mass Spectrometry， MS)，蛋白质组的生物信息学，研究发现中医肝风内动证三亚型有着共同的表达蛋白质―硫氧环蛋白过氧化物酶（TPx），现报道如下。 1对象与方法 外周血淋巴细胞的分离 细胞总蛋白质的提取 严格按照中医肝阳化风证、阴虚生风证、血虚生风证辨证标准选择患者[1]，肝阳化风证患者60例（脑梗死、脑出血、颈椎病、帕金森病各15例）；血虚生风证患者45例（脑出血、帕金森病、脑梗死各15例）；阴虚生风证患者30例（脑出血、脑梗死各15例）；15名健康志愿者。各抽取空腹外周静脉血10mL， 参照文献[2]并加以改良方法分离血清淋巴细胞，称50～60mg淋巴细胞加入80μL细胞裂解液，混合液氮反复研磨，并在震荡仪上震荡充分溶解，涡旋混匀，12000min 4℃离心1h，取上清即为细胞总蛋白质。取5μL分装待测，余样品保存至－70℃，用bradford 法BCA蛋白质定量试剂盒测定蛋白质浓度[3-4] 二维电泳和图像分析 参考Ameham公司二维凝胶电泳手册进行。采用采用24cm，PH7-10 IPG预制干胶条， 蛋白质上样量均为1000μg，二维电泳凝胶采用考马斯亮蓝显色，PDQuest 软件行蛋白质斑点检测和分析，蛋白质表达水平上升或下调200%的点为差异点，大于300%为显著差异点，进行鉴定。 胶内酶解和质谱分析 挖取差异表达的蛋白质点置于的Eppendorf管中，质谱步骤见表1。 将干燥的样品与基质（a-氰基-β-羟基肉桂酸）溶液充分混匀后点样与不锈钢样本靶上，室温晾干后Voyager-DE STR MALDI-TOF-MS质谱仪进行肽质量指纹谱的鉴定，获得肽片段质量指纹图谱由Internet(省略)在Swiss-prot数据库有哪些信誉好的足球投注网站进行蛋白鉴定，使用的检索软件为matrixscience公司提供的免费肽质量指纹图谱Mascot检索软件。 2结果 二维凝胶电泳图像分析 每组总蛋白质重复检测3次，其二维电泳图谱非常相似，Image Scanner扫描后，用PDQuest 软件分析软件寻找差异蛋白点。选择肝阳化风证组、血虚生风证组、阴虚生风证组、健康人组清晰的二维凝胶图谱，PDQuest 软件分析凝胶图像，获得差异表达蛋白，蛋白质点比率在～或2～3之间为差异点，小于或大于300%为显著差异蛋白点，比率在~2之间为相同表达蛋白质点。 比较肝阳化风证、血虚生风证、阴虚生风证各组与健康人组，找出各组与健康人组的差异蛋白质点（各组二维凝胶电泳图谱见图1），再比较肝阳化风证、血虚生风证、阴虚生风证3组，找出3组的共同表达蛋白质点（8号蛋白质点，局部放大图见图2），以健康人组为标准胶，此8号共同蛋白点在肝阳化风组中的表达比率为，阴虚生风组中为，血虚生风组为。即此共同点在肝阳化风组，血虚生风组中均表达下调，在血虚生风组显著下调，而在阴虚化风组中无明显变化。 差异蛋白点的质谱鉴定 笔者对8号差异蛋白质点用trypsin 进行胶内酶切，MALDI-TOF-MS 测定肽质量指纹，. com 网站上，利用MASCOT 软件检索Swissprot 蛋白质数据库进行了鉴定(肽质量指纹图谱见图3)，鉴定出此蛋白为硫氧环蛋白过氧化物酶，且在肝阳化风证、