实验新人必读(六)：外泌体实验研究的正确打开姿势!.pdfVIP

实验新人必读（六） ：外泌体实验研究的正确打开姿势！ 导语最近，外泌体在科研界以迅雷不及掩耳之势火了起 来，国自然中标量那是翻着倍的蹭蹭往上涨。然而目前外泌 体的研究仍处于初级阶段，首要原因就在于该领域里还木有 统一的、简单可行且纯度很高的分离方法，其次对其他囊泡 与外泌体的区别仍不能做出清楚的判断。 外泌体的藏身之处 正所谓高手在民间，欲一睹高人风采， 就必先找到高人隐身之处。通常外泌体藏身于细胞上清、血 液、尿液、脑脊液和其他体液。 血液 血液离心后有两种形 式：血清和血浆，但不少小伙伴对它们傻傻分不清楚。前者 是不经抗凝处理的血液会自动在一系列凝血因子的作用下 发生凝集，离心后的上层液体；后者是经抗凝剂处理后，离 心出去血细胞所得液体。两者虽然一母同胞，但显然血浆比 血清更有内涵，其包含一些纤维蛋白原以及大量的外泌体， 因而血浆也更受广大研究者的青睐。 Tips:1 ）血样抗凝剂花样繁多， 科研汪们一不小心就会跌的 鼻青脸肿。肝素除了会抑制 PCR 外，还可与外泌体结合阻 止细胞摄取外泌体；双嘧达莫（ CTAD ）则会阻止血小板的 激活并抑制其释放外泌体； EDTA 可能会干扰 PCR 反应 （尽 管其程度小于肝素） ，但是还是优于其他选择。 2 ）抽血时动作要轻柔迅速，并记录准确的抽血时间。因为 外泌体在抽血后 30 分钟内是稳定的，时间过长血小板会因 种种物理因素而被激活并释放外泌体，导致外泌体数量增加。 尿液 尿液中的外泌体性质稳定且 RNA 含量高于尿液中的细 胞内的 RNA 。而收集尿液时，应该尽量选择受试者的“新鲜” 尿液，并注意避免细菌污染。受试者的亲属（性别相同、年 龄相仿）可作为对照。同时也要注意对饮食的控制。 脑脊 液 脑脊液中的外泌体含量虽然较其他体液如血液少，但可 作为神经系统疾病的潜在生物标志物。采集脑脊液时避免受 到血液污染，一般由于健康对照脑脊液获取困难，往往以其 他神经异常的患者为对照。 外泌体的通缉之法 既然已经找 到了外泌体的藏身之处，接下来就是请高手出山了。正常情 况下外泌体是有侠义之风的，默默无闻的传递信号分子，以 激活下游信号通路，帮助其他细胞各司其职。比如树突状细 胞源性的外泌体则能够引起机体有效的抗肿瘤免疫应答。然 而一旦细胞变坏了，其分泌的外泌体也就成了恐怖份子，像 肿瘤细胞分泌的外泌体小哥就作恶多端，在机体中掀起了一 片腥风血雨，引得科研界中的各路人马纷纷亮出自家法宝对 其进行缉拿通缉。秘笈一：超速离心法 此秘笈普遍被科研 者所接受，通常与蔗糖密度梯度结合，使相对低密度的外泌 体漂浮起来。然而，此法比较耗时耗力，一般需要 8-30h ， 一次仅能处理 6 个样品，且产率较低，不适用于如血浆和血 清等粘性生物液体。然而却可以获得高纯度的外泌体，并且 这种方法在过去 10 年里已经被很多实验室成功应用于外泌 体的分离。 秘笈二：按照尺寸大小分离外泌体 BiooScientific 的 ExoMir 试剂盒通过两步超滤法就成功分离 纯化外泌体。第一个微型过滤器基本上能去除所有细胞、血 小板和细胞碎片，第二个微型过滤器可用正压力来获取所有 直径大于 30nm 的囊泡。该方法以 HPLC （高效液相层析） 为基础的方法有可能获得高纯度的外泌体，但是这个过程需 要专用设备。 秘笈三：外泌体沉淀 聚乙二醇（ PEGs ）通 常被用于病毒和其他小颗粒的沉淀。基于此，