2021年质粒DNA抽提实验报告.docVIP

2021年质粒DNA抽提实验报告 2021年质粒DNA抽提实验报告 PAGE / NUMPAGES 2021年质粒DNA抽提实验报告 质粒DNA抽提试验汇报 试验目: 1.掌握碱裂解法小量快速提取质粒DNA方法, 提取质粒DNA可直接用于酶切, PCR扩增等。 2.学习利用水平式琼脂糖凝脉电泳初步检测DNA纯度, 构型, 含量和分子量大小。 试验原理: 碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DN结果A变性与复性差异而达成分离目。在pH值高达12.6碱性条件下, 染色体DNA氢键断裂, 双螺旋结构解开而变性。质粒DNA大部分氢键也断裂, 但超螺旋共价闭合环状两条互补链不会完全分离, 当以pH4.8NaAc高盐缓冲液去调整其pH值至中性时, 变性质粒DNA又恢复原来构型, 保留在溶液中, 而染色体DNA不能复性而形成缠连网状结构, 经过离心, 染色体DNA与不稳定大分子RNA、 蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 试验仪器及试剂: 1.5mlEP管、 高速离心机、 移液枪 溶液I: 50 mmol/L 葡萄糖、 10 mmol/L EDTA、 25 mmol/L Tris-HCl （pH 8.0） 2毫克/毫升 溶菌酶 溶液II: 200 mmol/L NaOH、 1% SDS 溶液III: 3 mol/L NaAc （pH4.8）溶液、 TE缓冲液: 10 mmol/L Tris-HCl、 pH 7.51 mmol/L EDTA 试验步骤: 取1.5ml细胞培养物于1.5mlEP管中, 1rpm/min离心1min, 去上清液（反复一次） 2、 加200μl溶液Ⅰ重悬浮细胞 3、 加200μl溶液Ⅱ, 轻轻摇匀, 放置5min 4、 加150μl溶液, 轻轻摇匀, 冰浴5min, 1rpm/min离心5min 5、 取上清, 加入等体积氯仿, 摇匀, 1rpm/min离心10min 6、 去上清, 加入等体积异丙醇, 室温放置5min, 1rpm/min离心10min 7、 70%乙醇洗涤沉淀2次, 风干 8、 加20ddH2O溶解沉淀, -20℃下保留备用 五．试验结果: 得到大肠杆菌质粒DNA PCR以及电泳试验汇报 试验原理: PCR: 该技术是在模板DNA、 引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下, 依靠于DNA聚合酶酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板, 借助一小段双链DNA来开启合成, 经过一个或两个人工合成寡核苷酸引物与单链DNA模板中一段互补序列结合, 形成部分双链。在适宜温度和环境下, DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3′-OH末端, 并以此为起始点, 沿模板5′→3′方向延伸, 合成一条新DNA互补链。 电泳: 琼脂糖凝胶能够用于蛋白质和核酸电泳支持介质, 尤其适合于核酸提纯、 分析。如浓度为1%琼脂糖凝胶孔径对于蛋白质来说是比较大, 对蛋白质阻碍作用较小, 这时蛋白质分子大小对电泳迁移率影响相对较小, 所以适适用于部分忽略蛋白质大小而只依据蛋白质天然电荷来进行分离电泳技术, 如免疫电泳、 平板等电聚焦电泳等。琼脂糖也适合于DNA、 RNA分子分离、 分析, 因为DNA、 RNA分子通常较大, 所以在分离过程中会存在一定摩擦阻碍作用, 这时分子大小会对电泳迁移率产生显著影响。 二．试验仪器及试剂: EP管、 离心机、 PCR仪、 电泳槽、 电泳仪、 移液枪、 紫外透射检测仪等 DNA模板、 与特定DNA模板结合引物、 去离子水、 商业化DNA聚合酶以及缓冲液、 dNTP、 DNA荧光染料溴化乙锭、 琼脂糖凝胶 PCR反应体系（25μl）2× PCRmix 12.5μl 引物1 1μl 引物2 1μl 20ddH2O 10.5μl 操作步骤 1、 94℃预变性5min, 然后94℃, 30s-64℃, 45s-72℃, 1min循环7次 2、 94℃, 30s-55℃, 45s-72℃, 1min循环23次 3、 72℃, 10s 电泳检测 试验结果分析 分离不一样大小DNA片段所用最适凝胶浓度是不一样, 数据见下表: 如右图所表示: 试验所用琼脂糖凝胶浓度为1.3%, 试验DNA条带位置在500bp-750bp之间, 靠近500bp, 证实试验是成功 对照组试验组750bp500bp1000bpbp100bp250bp 如右图所表