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2021年质粒的提取酶切实验报告 2021年质粒的提取酶切实验报告 PAGE / NUMPAGES 2021年质粒的提取酶切实验报告 试验一 质粒提取酶切 试验目 掌握质粒小量快速提取法。用琼脂糖凝胶电泳法判定其纯度。 试验原理 　质粒是一个染色体外稳定遗传因子。大小在1~200kb之间, 含有双链闭合环状结构DNA分子。关键发觉于细菌、 放线菌和真菌细胞中。质粒含有自主复制和转录能力, 能使子代细胞保持它们恒定拷贝数, 可表示它携带遗传信息。她可独立游离在细胞质内, 也可整合到细菌染色体中, 它离开宿主细胞就不能存活, 而它控制很多生物学功效却给予宿主细胞一些表型。　　采取溶菌酶可破坏菌体细胞壁, 十二烷基磺酸钠（SDS）可使细胞壁裂解, 经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后, 细菌DNA缠绕附着在细胞壁碎片上, 离心时易被沉淀出来, 而质粒DNA则留在上清液中。用酒精沉淀洗涤, 可得到质粒DNA。　　在细胞内, 共价闭环DNA（cccDNA）常以超螺旋形式存在。若两条链中有一条链发生一处或多处断裂, 分子就能旋转而消除链张力, 这种松弛型分子叫作开环DNA（ocDNA）。在电泳时, 同一质粒如以cccDNA形式存在, 它比其开环和线状DNA泳动速度都快, 所以在本试验中, 质粒DNA在电泳凝胶中展现3条区带。　　限制性内切酶是一个工具酶, 这类酶特点是含有能够识别双链DNA分子上特异核苷酸次序能力, 能在这个特异性核苷酸序列内, 切断DNA双链, 形成一定长度和次序DNA片段。EcoR = 1 \* ROMAN I和Bgl = 2 \* ROMAN II识别序列和切口是: 　　 EcoR = 1 \* ROMAN I: G↓AATTC Bgl = 2 \* ROMAN II: A↓GATCT　　G, A等核苷酸表示酶识别序列, 箭头表示酶切口。限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切口, 就能产生多少酶切片段, 所以判定酶切后片段在电泳凝胶区带数, 就能够推断酶切口数目, 从片段迁移率能够大致判定酶切片段大小差异。用已知分子量线状DNA为对照, 经过电泳迁移率比较, 就能够粗略推测分子形状相同未知DNA分子量。 试验步骤 质粒提取1.培养细菌 将带有质粒DH5ɑ大肠杆菌接种于5ml含100μg/ml氨苄青霉素1×LB中, 37℃培养过夜。 2.取液体培养菌液1.5ml置塑料离心管中, 10 000r/min离心lmin, 去掉上清液。加入150μl溶液I, 充足混匀, 在室温下放置10min。 3.加入200μl新配制溶液II, 加盖后温和颠倒5~10次, 使之混匀, 冰上放置2min。 4.加入150μl冰凉溶液III, 加盖后温和颠倒5~10次, 使之混匀, 冰上放置10min。 5.用台式高速离心机, 10 000r/min离心5min, 将上清液移入洁净离心管中。 6.向上清液中加入等体积酚/氯仿（1: 1, v/v）, 振荡混匀, 转速10 000r/min, 离心2min, 将上清液转移至新离心管中。 7.向上清液加5mol/LNaCl至终浓度为0.3mol/L, 混匀, 再加入2倍体积无水乙醇, 混匀, 室温放置2min, 离心5min, 倒去上清乙醇溶液, 把离心管倒扣在吸水纸上, 吸干液体。 8.加0.5ml 70%乙醇, 振荡并离心, 倒去上清液, 真空抽干或室温自然干燥。 9.加入50μl含RNase A 20μg/mlTE缓冲液溶解提取物, 室温放置30min以上, 使DNA充足溶解待用或置-20℃备用 （也可用试剂盒按操作步骤提取质粒）10.将抽提出来质粒进行琼脂糖凝胶电泳 质粒酶切和判定 质粒DNA酶切加样 重组质粒 5μL 10× buffer 1μL Bgl = 2 \* ROMAN II 1μL EcoR = 1 \* ROMAN I 1μL ddH2O 2μL 加样后进行金属浴 4h ℃ 再进行琼脂糖凝胶电泳 结果与分析