2021年质粒DNA的小量提取及DNA琼脂糖凝胶电泳实验报告.docVIP

2021年质粒DNA的小量提取及DNA琼脂糖凝胶电泳实验报告 2021年质粒DNA的小量提取及DNA琼脂糖凝胶电泳实验报告 PAGE / NUMPAGES 2021年质粒DNA的小量提取及DNA琼脂糖凝胶电泳实验报告 质粒DNA小量提取及DNA琼脂糖凝胶电泳 一、 序言 质粒 质粒是附加到细胞中非细胞 染色体或核区 DNA原有能够自主复制较小DNA分子(即细胞附殖粒、 又胞附殖粒)。大部分质粒即使都是环状构型, 它存在于很多细菌以及酵母菌等生物（多为 原核生物）中, 乃至于植物 线粒体等胞器中。然而, 1984年, 在Streptomyces coelicoler( 天蓝色链霉菌)等 放线菌以及在Borrelia hermsii(赫氏蜱疏螺旋体)等原核生物中, 又相继发觉线形质粒。 天然质粒DNA长度从数千碱基对至数十万碱基对都有。质粒天然存在于这些生物里面, 有时候一个细胞里面能够同时有一个乃至于数种质粒同时存在。质粒套数在细胞里从单一到数千都有可能。有时有些质粒含有某种抗药基因(如大肠杆菌中就有含有抗 四环素基因质粒)。有部分质粒携带基因则能够给予细胞额外生理代谢能力, 乃至于在部分细菌中提升它致病力。通常来说, 质粒存在是否对宿主细胞生存没有决定性作用。它是基因工程最常见运载体。 质粒在细胞内复制通常有两种类型:紧密控制型和松弛控制型。前者只在细胞周期一定阶段进行复制, 当染色体不复制时, 它也不能复制, 通常每个细胞内只含有一个或多个质粒分子, 如F因子。后者质粒在整个细胞周期中随时能够复制, 在每个细胞中有很多拷贝, 通常在20个以上, 如 Col E1质粒。在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时, 细胞内蛋白质合成、 染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制, 紧密型质粒复制停止, 而 松弛型质粒继续复制, 质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个, 此时质粒DNA占总DNA含量可由原来2%增加至40-50%。 把一个有用目DNA片段经过重组DNA技术, 送进受体细胞中去进行繁殖和表示工具叫载体。细菌质粒是重组DNA 技术中常见载体。质粒分子本身是含有复制功效遗传结构。质粒还带有一些遗传信息, 所以会给予宿主细胞部分遗传性状。其自我复制能力及所携带遗传信息在重组DNA操作, 如扩增、 筛选过程中都是极为有用。 质粒载体是在天然质粒基础上为适应试验室操作而进行人工构建。与天然质粒相比, 质粒载体通常带有一个或一个以上选择性标识基因(如抗生素 抗性基因)和一个人工合成含有多个限制性内切酶识别位点多克隆位点序列, 并去掉了大部分非必需序列, 使分子量尽可能降低, 方便于基因工程操作。大多质粒载体带有部分多用途辅助序列, 这些用途包含经过 组织化学方法肉眼判定重组克隆、 产生用于序列测定单链DNA、 体外转录外源DNA序列、 判定片段插入方向、 外源基因大量表示等。一个理想克隆载体大致应有下列部分特征:⑴分子量小、 多拷贝、 松弛控制型;⑵含有多个常见限制性内切酶单切点;⑶能插入较大外源DNA片段;⑷含有两个以上遗传标识物, 便于判定和筛选。⑸对宿主细胞无害。常见质粒载体大小通常在1kb至10kb之间, 如PBR322、 PUC系列、 PGEM系列和pBluescript(简称pBS)等。 质粒不兼容性 利用同一复制系统不一样质粒不能在同一宿主细胞中共同存在, 当两种质粒同时导入同一细胞时, 它们在复制及随即分配到子细胞过程中相互竞争, 在部分细胞中, 一个质粒占优势, 而在另部分细胞中另一个质粒却占上风。当细胞生长几代后, 占少数质粒将会丢失, 所以在细胞后代中只有两种质粒一个, 这种现象称质粒不相容性。 琼脂糖凝胶 从琼脂中除去带电荷琼脂胶后, 剩下不含磺酸基团、 羧酸基团等带电荷基团中性部分, 结构是链状聚半乳糖, 易溶于沸水, 冷却后可依靠糖基间氢键引力形成网状结构凝胶。凝胶网孔大小和凝胶机械强度取决于琼脂糖浓度。所以琼脂糖凝胶可作为分子筛, 常见于凝胶层析和电泳。?从琼脂中除去带电荷琼脂胶后, 剩下不含磺酸基团、 羧酸基团等带电荷基团中性部分, 结构是链状聚半乳糖, 易溶于沸水, 冷却后可依靠糖基间氢键引力形成网状结构凝胶。凝胶网孔大小和凝胶机械强度取决于琼脂糖浓度。所以琼脂糖凝胶可作为分子筛, 常见于凝胶层析和电泳。 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是用 琼脂糖作支持介质一个 电泳方法。其分析原理与其她支持物电泳最关键区分是:它兼有 分子筛和电泳双重作用。 琼脂糖凝胶含有网络结构, 物质分子经过时会受到 阻力, 大分子物质在涌动时受到阻力大, 所以在凝胶电泳中, 带电颗粒分离不仅取决于净电荷性质和数量, 而且还取决于分子大小, 这就大大提升了分