附录2青霉素效价测定.docVIP

附录2、青霉素效价的测定 一、实验内容与目的 采用纸片法测定青霉素效价。通过本实验,掌握抗生素效价测定的方法 和技术。 二、实验原理 抗生素的生物效价测定,常用稀释法、比浊法和扩散法(或称渗透法)。扩散法使用固体培养基,使样品液或含有抗生素的物质与有试验菌的培养基接触,经过培养后因抗生素的扩散,细菌不能生长形成透明的抑菌圈。扩散法有几种其中管碟扩散法(简称管碟法)为国际上常用的方法将已知效价的标准样品和待测样品的溶液分别进行扩散法实验在一定的浓度范围内,抗生素的浓度与抑菌圈直径在双周半对数表(浓度为对数值,抑菌圈直径为数字值)上成直线函数关系,根据样品的抑菌圈直径可在标准曲线上求得其效价。 三、实验材料 1.材料 (1)测定用指示菌:金黄色葡萄球菌。 (2)青霉素发酵液 2.培养基 (1)1#培养基:牛肉膏蛋白胨培养基,20%琼脂。培养指示菌使用 (2)2#培养基:牛肉膏蛋白胨培养基,培养皿内培养基分上下两层,上层 培养基需另加0.5%葡萄糖,即每100mL上层培养基中加入50%葡萄糖溶液 1mL。青霉素效价测定使用 3.主要试剂 磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钠、氨苄青霉素。 4.主要仪器设备 高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、高速离心机、分光光度计、牛津杯(不锈钢 管,内径6mm,外径8mm,高10mm)、培养皿、无菌滴管、游标卡尺、显微 镜、血球计数板、恒温培养箱、电子天平等。 四、实验步骤 1、首先准备直径为7mm的圆形滤纸片若干，灭菌。 金黄色葡萄球菌悬液的制备 2、培养基配制（菌种活化） （1）、酵母浸膏 0.2%；蛋白胨 0.5%；氯化钠 0.2%；淀粉 1.0%；琼脂粉 1.7%，混合加热配制成培养基 （2）、配制40%葡萄糖溶液。 （3）、将（1）和（2）两溶液分别在115℃灭菌 20 min。 （4）、将灭菌后的（1）和（2）液在 60℃时混合，按照 125mL（2）液加入875mL（1） 液中，葡萄糖终浓度为 5%，到入试管，倾斜放置使培养基形成斜面，冷却后使用。 （5）、将金黄色葡萄球菌在斜面培养基上连续培养3或4代(37℃,16~18h/代),充分活化。 （6）、然后用灭菌的0.85%NaCl溶液洗下,8000/min离心5min,弃上清(3)将菌体沉淀再用0.85%NaCl溶液洗1或2次,离心取沉淀(4)最后将菌液稀释至一定浓度,约109个/mL,或用分光光度计测定,透 光率为20%(波长650nm处) 3、配制磷酸钾缓冲液(0.2mol/L,pH6.0) 称取0.8g磷酸二氢钾和0.2g磷酸氢二钾,用蒸馏水溶解并定容至100mn-, 灭菌备用。 4、标准曲线的绘制 (1)、青霉素标准溶液的配制。 准确称取氨苄青霉素标准品15~20mg,用磷酸钾缓冲液(0.2mol/L,pH6.0)溶解,终浓度为2000U/mL,然后稀释配制成10U/mL的青霉素工作液。再用磷酸钾缓冲液(0.2mo/L,p6.0)将工作液稀释配制成一系列浓度的青霉素标准溶液,即0.4U/mL、0.6U/mL、0.8UJ/mL、1.0U/mL、1.2U/mL和1.4U/mL； (2)、取灭菌培养皿18个,每皿加入已冷至45℃左右的1#培养基20mL,水平放置,使其凝固； (3)、用移液枪将1mL金黄色葡萄球菌混悬液加到培养基表面，用涂布棒涂抹均匀； (4)、 在每个平板中等距离均匀放置牛津杯6个。 (5)在每个平板上的6个牛津杯间隔的3个中各加入1U/mL的标准品溶液 (图1-2中A所示),将每3个平板组成一组,共分6组。在第一组的每个平板的 3个空牛津杯中均加入0.4U/mL的标准液,如此依次将6种不同浓度的标准溶 液分别加入6组平板中,即图1-2中B、C所示。每一浓度做3皿重复。 (6)将全部平板盖上陶瓦盖后,置于37℃恒温培养箱中,恒温培养 18~24h。 (7)取出平板,移去牛津杯,用游标卡尺测量各抑菌圈直径。 (四)待测品的测定 (1)取灭菌培养皿3个,按上述方法制备双层平板。在每个双层平板中等距 离均匀放置牛津杯6个 (2)用磷酸钾缓冲液(0.2mol/L,pH6.0)将青霉素发酵液适当稀释 3)在每个平板上的6个牛津杯间隔的3个中各加入1U/mL的标准品溶 液,其他3个空牛津杯中各加入适当稀释的样品发酵液 (4)将全部平板盖上陶瓦盖后,置于37℃恒温培养箱中,恒温培养18~24h (5)取出平板,移去牛津杯,用游标卡尺测量各抑菌圈直径 五、实验讨论与注意事项 (1)所选培养皿应做到直径、深度一致,皿底平坦 (2)青霉素溶液的抑菌圈大小与上层培养基内菌体的浓度密切相关。增加细 菌浓度,抑菌圈就缩小。因此,应注意控制金黄色葡萄球菌菌液的浓度,一般以 100mL的2#培养基中加入3~5mL金黄色葡萄球菌菌液(109个/mL)