蛋白质的性质实验(二).pdfVIP

蛋白质的性质实验（二） 蛋白质的等电点测定和沉淀反应 　　一、蛋白质等 电点的测定 　　 1．目的 　　（ 1）了解蛋白质的两性解离性质。 　　（2）学习测定蛋白质等电点的一种方法。 　　2．原理 　　蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在下列平衡： 　　蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当溶 液的pH 达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在 电场中， 蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH 值称为此种蛋 白质的等电点。不同蛋白质各有其特异的等电点。在等电点时，蛋白质 的理化性质都有 化，可利用此种性质的 化测定各种蛋白质的等电点。 最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液 pH 值。 　　本实验借观察在不同pH 溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。 用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白溶液中）配制成各种不同 pH 值的 缓冲液。向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH 值 即为酪蛋白的等电点。 　　3．器材 　　 　　4．试剂 　　（ 1）0.4％酪蛋白醋酸钠溶液 200mL 　　取 0.4g 酪蛋白，加少量水在乳钵中仔细地研磨，将所得的蛋白质 悬胶液移入 200 mL 锥形瓶内，用少量 40～50 ℃的 温水洗涤乳钵，将 洗涤液也移入锥形瓶内。加入 10 mL1 mol／L 醋酸钠溶液。把锥形瓶放 到 50℃水浴中，并小心地旋转锥形瓶，直到酪蛋白完全溶解为止。将锥 形瓶内的溶液全部移至 100 mL 容量瓶内，加水至刻度，塞紧玻塞，混匀。 　　 　　5．操作 　　（ 1）取同样规格的试管 4 支，按下表顺序分别精确地加入各试剂， 然后混匀。 　　（2）向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液 1mL，加一管，摇匀一 管。此时 1、2、3、4 管的 pH 依次为 5.9、5.3、4.7、3.5。观察其混浊度。静 置 10 分钟后，再观察其混浊度。最混浊的一管的 pH 即为酪蛋白的等电 点。 　　二、蛋白质的沉淀及 性 　　 1．目的 　　（ 1）加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。 　　（2）了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。 　　（3）了解蛋白质 性与沉淀的关系。 　　2．原理 　　在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双 电层而成为 稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去 电荷和脱水而沉淀。 　　蛋白质的沉淀反应可分为两类。 　　（ 1）可逆的沉淀反应 此时蛋白质分子的结构尚未发生显著 化， 除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保 持其天然性质而不 性。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇 （或丙酮）短时间作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常利用此类反应。 　　（2）不可逆沉淀反应 此时蛋白质分子内部结构发生重大改 ，蛋 白质常 性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。加热引起的蛋白质沉淀与凝 固，蛋白质与重金属离子或某些有机酸的反应都属于此类。 　　蛋白质 性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷）， 并不析出。因此 性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也 未必都已 性。 　　3．试剂与材料 　　（ 1）蛋白质溶液 500mL 　　5％卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液（新鲜鸡蛋清：水= 1∶9） 　　 　　4．操作 　　（ 1）蛋白质的盐析 无机盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）的浓溶液 能析出蛋白质。盐的浓度不同，析出的蛋白质也不同。 　　如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫 酸铵溶液中才能析出。 　　由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，故 蛋白质的盐析作用是可逆过程。