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蛋白质等电点测定及性质实验 一、目的： 了解等电点的意义及其与蛋白质分子聚沉能力的关系。 初步学会测定蛋白质等 电点的基本方法，了解蛋白质的性质。 二、原理： 固体颗粒在液体中为什么能够带电 ？ 当固体与液体接触时，固体可以从溶液中选择性吸附某种离子， 也可以是固体分子本身发生电离作用而使离子进入溶液，以致使固液 两相分别带有不同符号的 电荷， 由于电中性的要求，带电表面附近的 液体中必有与固体数量相等但符号相反的多余的反离子。在界面上带 电表面和反离子形成了双电层的结构。 在两种不同物质的界面上，正 负电荷分别排列成的面层。 对于双电层的具体结构，一百多年来不同学者提出了不同的看法。最早于 1879 年 Helmholz 提出平板型模型；1910 年 Gouy 和 1913 年 Chapman 修正了平板型模型，提出了扩 散双电层模型；后来 Stern 又提出了 Stern 模型。 根据 O.斯特恩的观点，一部分反离子由于电性吸引或非电性的特性吸引作用（例如范 德华力）而和表面紧密结合，构成（或称紧密层、斯特恩层）。其余的离子则扩散地分布在 溶液中，构成双电层的（或称滑移面）。由于带电表面的吸引作用，在中反离子的浓度远大 于同号离子。离表面越远，过剩的反离子越少，直至在溶液内部反离子的浓度与同号离子相 等。 紧密层：溶液中反离子及溶剂分子受到足够大的静电力，范德华力或特性吸附力，而紧 密吸附在固体表面上。其余反离子则构成扩散层。 滑动面：指固液两相发生相对移动的界面，是凹凸不平的曲面。滑动面至溶液本体间 电势差称为ζ 电势。 固体颗粒带电量的大小及测量方式？ ζ 电势只有在固液两相发生相对移动时才能呈现出来。ζ 电势的大小由Zeta 电位表示， 其数值的大小反映了胶粒带电的程度，其数值越高表明胶粒带电越多，扩散层越厚。一般来 说，以 pH 值为横坐标，Zeta 电位为纵坐标作图，Zeta 电位为零对应 pH 值即为等电点。 对于蛋白质分子来说： 蛋白质分子的大小在范围内，约 1～100 微米。大部分蛋白质分子的表面都有很多亲水 集团，这些集团以形式与进行，使吸附在蛋白质分子表面而形成一层水合膜，具有；又由于 蛋白质分子表面的亲水集团都带有电荷，会与极性中的异性电荷吸引形成。而水合膜和的存 在，使蛋白质的分子与分子之间不会相互凝聚，成为比较稳定的。如果消除水合膜或其中一 个因素，蛋白质溶液就会变得不稳定，两种因素都消除时，蛋白质分子就会互相凝聚成较大 的分子而产生沉淀。在生活实践中，常利用蛋白质的胶体性质沉淀或分离蛋白质。如做豆腐、 就是利用蛋白质的。 蛋白质分子所带的电荷与溶液 pH 值有很大关系，蛋白质是两性电解质，在酸性溶液 + - 中的氨基酸分子氨基形成-NH3 而带正电，在碱性溶液中羧基形成-COO 而带负电： 蛋白质分子所带净电荷为零时 pH 值称为蛋白质的等电点（PI ）。其定义为：在某一pH 的溶液中，蛋白质解离成阳离子和阴离子的趋势或程度相等时，呈电中性，此时溶液 pH 称为该蛋白质的等电点。 等电点的应用：主要用于蛋白质等两性电解质的分离、提纯和电泳。 蛋白质等电点的测量方式：溶解度最低时的溶液 pH 。 在等电点时，蛋白质分子在电场中不向任何一极移动，而且分子与分子间因碰撞而引 起聚沉的倾向增加，所以这时可以使蛋白质溶液的粘度、渗透压均减到最低，且溶液变混浊。 蛋白质在等电点时溶解度最小，最容易沉淀析出。 蛋白质等电点的测定 各种蛋白质的等电点都不相同，但偏酸性的较多，如牛乳中的酪蛋白的等电点是 4.7~4.8 ，血红蛋白等电点为 6.7~6.8，胰岛素是 5.3~5.4，鱼精蛋白是一个典型的碱性蛋白， 其等电点在 pH 12.0~12.4 。 本实验采用蛋白质在不同 pH 溶液中形成的混浊度来确定，即混浊度最大时 pH 值即 为该种蛋白质的等电点值，这个方法虽然不很准确，但在一般实验条件下都能进行，操作也