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* 4．操作步骤 1）大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法) （1）从新活化的E.coli DH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于3～5ml LB液体培养中，37℃振荡培养12h左右，直至对数生长期。将该菌悬液以1:100～1:50转接于100ml LB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20～30min测一次OD600nm，至OD600nm≤0.5时停止培养； （2）每组取培养液3个2ml转入2ml离心管中，在冰上冷却20-30min，于4℃，4000r／min离心10min（从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）； （3）倒净上清培养液，用1ml冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴； （4）0～4℃，4000r／min离心10min； （5）弃去上清液，加入500μl冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞。0～4℃，4000r／min离心10min； （6）弃去上清液，加入100μl冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液； （7）制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，也可加入占总体积15％左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，置于-70℃条件下，可保存半年至一年。 2）细胞转化 (1) 分别取3个100μl感受态细胞悬液(如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操作)，第一组，加入1μl重组质粒DNA(体积不超过10μl)+ 100μl感受态细胞，此管为转化实验组。第二组，质粒DNA对照组1μl+100μl感受态细胞悬液。 (2) 将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置20-30min，于42℃水浴中保温60－90S，然后迅速冰上冷却2min (3) 立即向上述管中分别加入0.4ml LB液体培养基（不需在冰上操作），使总体积到0.5ml，该溶液称为转化反应原液，摇匀后于37℃振荡培养约30min ，使受体菌恢复正常生长状态，并使转化体表达抗生素基因产物(Ampr)。 3) 平板培养（有时需要稀释） 取各样品培养液0.1ml，分别接种于含抗菌素LB平板培养基上，涂匀（如果用玻璃棒涂抹，酒精灯烧过后稍微凉一下再用，不要过烫）。
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