研究简报人趋化因子MIP3α的原核可溶性表达及趋化活性分析中国.doc

研究简报 人趋化因子MIP3α的原核可溶性 表达及趋化活性分析 中国生物工程杂志China Biotechnology, 2005, 25(11):66～70 余相*刘瑞玉刘集鸿 （广东省惠州市中心人民医院检验中心惠州516001） 摘要目的：克隆人趋化因子MIP3α，进行原核表达并初步鉴定其趋化活性。方法：从人扁桃体中提取总RNA，进行RTPCR，扩增MIP3α成熟蛋白基因，重组于pET32a(+)载体，转化大肠杆菌BL21TrxB(DE3)，进行融合表达，Western blot验证融合蛋白，金属离子亲和层析，肠激酶酶切，弱阳离子交换层析，得到纯化的MIP3α蛋白，趋化试验鉴定其趋化活性。结果：成功构建了MIP3α天然蛋白的硫氧还蛋白融合表达载体，表达并纯化出MIP3α蛋白，Western blot证明融合蛋白能与羊抗人MIP3α抗体结合，纯化的MIP3α蛋白能趋化HEK293CCR6稳定转染细胞。结论：构建的天然MIP3α融合表达载体以可溶性蛋白的方式稳定表达MIP3α，初步纯化得到的MIP3α具有趋化HEK293CCR6稳定转染细胞的活性。 关键词MIP3α融合表达蛋白纯化 收稿日期：2005-05-30修回日期：20050621 *电子信箱：sdb1228@趋化因子是一类能趋化细胞作定向移动的小分子分泌蛋白，在病原菌的清除、炎症反应、移植排斥、造血、血管生成、肿瘤发生、HIV感染等过程中发挥着重要作用。根据其蛋白质序列中前2个保守的半胱氨酸排列的位置分为4个亚类：CC、CXC、CX3C和C类。巨噬细胞炎性蛋白3α(macrophage inflammatory protein 3α，MIP3α)是由表皮角质形成细胞在IL2和TNFα的刺激下分泌的一类CC族趋化因子，其配体现仅发现CCR6，在体内特异性趋化CCR6表达细胞向抗原出现的组织部位定向迁移，是异体皮肤移植后发生免疫排斥的主要原因之一［1~3］。 1材料与方法1.1材料 1.1.1质粒、菌株与试剂pET32a(+)质粒、大肠杆菌DH5a、大肠杆菌BL21TrxB(DE3)、HEK293细胞、HEK293CCR6由本室保存， pET32a(+)质粒含T7启动子和氨苄青霉素抗性基因；大肠杆菌BL21TrxB(DE3)含卡那霉素抗性基因，IPTG可诱导其表达目的蛋白；HEK293细胞培养基为DMEM完全培养基，含10%小牛血清。 1.1.2酶及其他试剂总RNA提取试剂Tripure Isolation Reagent、质粒提取试剂盒High Pure Plasmid Isolation Kit、肠激酶均为德国Roche公司产品；逆转录试剂盒ImpromII RT System、高保真热稳定DNA聚合酶Tli、琼脂糖凝胶回收试剂盒WizardSV Gel and PCR CleanUp System、限制性内切酶Nco I和EcoR I、T4 DNA连接酶均为美国Promega公司产品；羊抗人MIP3α多抗购自RD公司，兔抗羊二抗（辣根过氧化物酶标记）购自北京中山生物技术有限公司；TALON 金属离子亲和层析树脂购自Clontech公司；AKTARExplorer高效层析系统、Hiprep26/10除盐柱、Hiprep16/10 CM FF弱阳离子交换柱均为英国Amersham Pharmacia公司产品；微孔板（Costar3421）购自美国Corning公司；其他普通试剂为国产分析纯。 1.2方法 1.2.1总RNA提取及MIP3α基因cDNA第一链合成采用Tripure试剂提取扁桃体 (慢性扁桃体炎患者手术摘除的扁桃体) 总RNA，操作步骤按说明书进行。提取的总RNA 1μg与Oligo(dT) 1μl冰上结合，70℃ 5min，立即冰浴10min，再加入5×Buffer 4μl，25mmol/L MgCl2 4.8μl，10mmol/L dNTP 1μl，RNA酶抑制剂0.5μl，ImpromII 逆转录酶1μl，加入无核酸酶的水补足总体积至20μl，混匀后按如下程序进行逆转录：25℃ 5min，42℃ 1h，70℃ 15min。 2005, 25(11)余相 等：人趋化因子MIP3α的原核可溶性表达及趋化活性分析 中国生物工程杂志 China Biotechnology Vol.25 No.11 2005 1.2.2PCR扩增MIP3α cDNA片段根据GenBank中编码MIP3α蛋白的cDNA序列，设计引物，上游引物：5′CATGCCATGGCTGCAAGCAACTTTGACTGCT3′,下游引物：5′CGGAATTCCTACAGGTTCTTGACTTTTTT3′，上游引物5′端引入Nco