课件：实习二食品蛋白质及氨基酸的测定.pptVIP

2.薄层色谱法（薄层层析法-TLC 法） 原理： 取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄层板上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，样品各组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交换等作用，同一物质具有相同的Rf值，不同成分则有不同的Rf值，因而各种混合物可达到彼此被分离的目的。然后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行对比，鉴别各种氨基酸种类，从显色斑点颜色的深浅可以大致确定其含量。 3.氨基酸自动分析仪法 4.气相色谱法 5.高效液相色谱法 小结 凯氏定氮法原理、分步、测定方法。 双缩脲法测定原理。 氨基酸总量的测定方法（甲醛滴定法）。 THANK YOU SUCCESS * * 可编辑 6.注意事项 当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30％过氧化氢 2—3 m1 后再继续加热消化。 消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下消化不完全而造成氮损失。 样品含脂肪或糖较多时，消化时间要长些。同时注意消化过程中产生泡沫溢出瓶外。 在蒸馏过程中注意接头处有无松漏现象。 蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1分钟后关掉热源．否则可能造成吸收液倒吸。 二、微量凯氏定氮法 1、原理及适用范围同前 2、与常量法不同点： 加入硼酸量有50 ml、10 ml, 滴定用盐酸浓度由0.1 mol/L-0.01 mol/L , 可用微量滴定管。 3、蒸馏装置 三、自动凯氏定氮法 1、原理及适用范围同前 2、特点： （1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。 （2）快速：一次可同时消化8个样品，30分钟可消化完毕。 （3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，12分钟完成1个样。 四、双缩脲法 传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏度高、准确，不要大仪器，但费时间，有环境污染。 新开发的：双缩脲法、 紫外分光光度法、 染料结合法、 水杨酸比色法等。 都是快速测定蛋白质的方法 1、原理 当脲（尿素NH2—CO—NH2）加热至150～160℃时，可由两个分子间脱去一个氨分子而生成二缩脲（也叫双缩脲），反应式如下： 四、双缩脲法 双缩脲与碱及少量硫酸铜溶液作用生成紫红色的配合物，此反应称为双缩脲反应。 蛋白质分子含有肽键, 与双缩脲结构相似，故也能呈现此反应而生成紫红色配合物 在一定条件下其颜色深浅与蛋白质含量成正比，据此可用吸收光度法来测定蛋白质含量，该配合物的最大吸收波长为560nm。 THANK YOU SUCCESS * * 可编辑 2.方法特点及应用范围 本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。本法亦适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定 3.主要仪器： 分光光度计，离心机（4000 r/min） 4. 试剂： (1)碱性硫酸铜溶液 (2)四氯化碳 5．操作方法 ①?标准曲线的绘制 采用凯氏法测出的蛋白质样品为标准样绘标准曲线。 显色（加入试剂静置1小时） 比色（取上清离心） ②?样品的测定 显色 比色 查标准曲线 6、结果计算 蛋白质（mg/100g）= 式中：c—由标准曲线上查得的蛋白质mg数； m—样品质量，g 7、说明及注意事项 ①蛋白质的种类不同，对发色程度的影响 不大，有大量脂肪存在时，会出现混浊可以先脱脂 ②标准曲线作完整后，无需每次再作标准 曲线 ③样品含有脯氨酸且有大量糖类存在时，显色不好还会出现结果偏低。 五、紫外吸收法 1．原理：利用蛋白质的特有基团，对紫外光有吸收作用在280 nm下，吸光度与蛋白质浓度成直线关系，求含量。 2．适用范围：常用于生物化学工作，因为干扰因素多，故在食品分析领域应用不广泛。 3．主要仪器： ①紫外分光光度计 ②离心机（3000 — 5000 r/min） 4．操作：用凯氏法测定作标样做标准曲线 第三节 挥发性盐基氮的测定 挥发性盐基氮是指动物性食品由于酶和细菌的作用，在腐败过程中，使蛋白质分解而产生氨以及胺类等碱性含氮物质。此类物质具有挥发性，在碱性溶液中蒸出后，用标准酸滴定计算含量。 1.原理 挥发性盐基氮遇到弱碱氧化镁游离蒸馏出来，蒸馏出来的氨，被硼酸吸收后生成硼酸铵，使吸收液变为碱性，混合指示剂由紫色变为绿色。再由标准盐酸滴定至紫色。 2 、试剂 2.1 氧化镁混悬液（ 10g/L ）：称取 1.0g 氧 化镁，加 100mL水，振摇成混悬液。 2.2 硼酸吸收液（ 20g/