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第四单元体外放射分析 邹洪波 放射免疫分析技术 目的：简述原理 理解技术关键及实际的操作中的注意事项。 体外放射分析是60年代以来迅速发展起来的超微量体外测定技术，按其原理分为 1 竞争放射分析（又称饱和分析）包括放射免疫分析（RIA），竞争性结合蛋白分析（CPBA），放射受体分析（RBA）。 2 非竞争性放射分析，免疫放射分析（IRMA）。 特点： 1 放射性测量灵敏度可达10-9~-15 g。 2 结合试剂特异性强 3 适用面广，所有生物活性物质，只要含量不低于RIA的检测极限，都可建立适当的测定方法。 4 测定试剂商品化，药盒化，样品测定自动化，数据处理微机化。 一、实验原理： 是“竞争抑制反应”，因为标记物和被测物对特异性结合剂均具有相同的结合能力，所以在特异性结合剂有限时，这种结合就出现相互竞争、彼此制约。 P* + Q P*-Q （一定量的标记物） （有限量的特异结合剂）（标记物与结合剂的复合物） + P（可变量的非标记被测物） | P-Q （非标记被测物与结合剂的复合物） *P ：标记物 ， P ：未标记物 Q ： 特异性结合剂 量—效关系 一般抗体抗原结合反应为均一单价的，且遵循作用定律 反应平衡时 KA=K1/K2=[PQ]/[P][Q] 通过数学推导效应（B，F，B/F）对剂量（P）的函数式为： ?B2-B（1+q/p+1/KA×p)+q/p=0 ?F2-F(1- q/p-1/KA×p)+1/KA×p=0 ?(B/F)2+B/F(1+KAP-KAq)-KAq=0 特点：1它们均呈视为一元二次方程，在直角坐标上为双曲线。2KA值决定曲线的灵敏度，特异性结合试剂的量只能是有限量，一般在抗原的浓度33~35%，抗体形成复合物时其效应才产生明显的改变，从而提高测定的灵敏度。3 KA值对每一种测定中均有各自的数值，通常一般抗体的KA在10 9~11 L/mol之间。 KA计算：B/F=KA×q-KA× [PQ] 斜率=-KA 三 基本试剂 （一）标准品 是样品定量的基础，它的质和量发生变化会直接影响样品的测定值。 要求：1 与待测物应为同种物质。 2 结合反应时，与待测物有相等的亲和力和活性。 3 高度纯化。 （二）标记物 通常选用125I和3H 125I 高比度 2175Ci/mmol（减少计数误差，灵敏度高），非同位素标记，标记条件不当可导致主体构型 变化，影响生物活性和免疫学活性。 3H 同位素标记影响因素少，S.A(29Ci/mmol)不及125I标记，货架寿命比125I（ 125I 2月）长（3H 2年）。 （三） 特异性结合试剂： 要求：1 、与待测物很高的亲和力 高亲和力的抗体获得斜率高的标准曲线，斜率高的标准曲线是高灵敏度和高精密度的必备条件。 平衡常数KA又称亲和常数，或叫做结合常数。该常数对特定的抗原抗体反应系统是固定不变的。KA的单位为1mol或L/mol。 其意义在于可用KA值反映抗体的亲和力。KA值与游离抗体浓度呈反比关系。KA值越大，则游离的抗体浓度［Ab］越小，结合的抗原抗体复合物［Ag-Ab］浓度越大。即抗原抗体的结合力越大。K值是与抗原抗体共同相关的数值，不能认为仅仅是抗体(或抗原)之间的K值。 2 高度特异性结合。 特异性不高容易与样品中待测物中结构相近的类似物结合，影响分析结果。 3 高滴度。指抗体实际应用时的稀释倍数，滴度越高，则抗体用量越少，当滴度在1：1000以上时，抗血清可不用纯化。实际采用时可作抗血清稀释实验，选用50%结合时的稀释度。 三类特异性结合试剂比较 （四）缓冲液，添加剂 PH 7.4~7.8，离子强度50~100mM ；0 .5%BAS(减少非特异性结合）；2~2.5%兔血清（使复合物沉淀好）。 （五）分离剂 要求：分离完全，简便快捷，价廉，重复性好。 四 实验步骤 （一）标准曲线：系列已知量的标准与样品同步测定 （二）实验总体积小：要求，准确 1 平衡法 2 顺序加样法 样品