脊髓小脑性共济失调分子遗传学诊断与发病机制研究-神经病学专业论文.docx

◇!±兰! ◇ !±兰! 堂壁i：墅丝茎堕叁塑坌三堂堂堡堑曼垄壅垫型堡塞 脊髓小脑性共济失调分子遗传学诊断与发病机制研究 专 业：神经病学 博士研究生：谢秋幼 导 师：梁秀龄教授 中山大学附属第一医院神经科广州510080 摘 要 研究背景： 脊髓小脑性共济失调(Spinocerebellar ataxia，SCA)是一类由于遗传因素造 成的单基因神经系统变性疾病，临床主要表现为小脑性共济失调，伴构音障碍、 意向性震颤、眼肌麻痹，锥体和(或)锥体外系征等。其病理改变形式主要是神 经元细胞脱失和胶质增生，含有多聚谷氨酰胺的突变蛋白在细胞核内沉积形成核 内包涵体。虽然基底节、视神经、周围神经等也可被累及，但病变部位主要在脊 髓、脑干、小脑。SCA这一大类疾病多为不同染色体区带上存在着三核苷酸(多 数为CAG)的扩增位点，导致三核苷酸重复(Trinucleotide repeat，TNR)数目的 变化即动态突变(Dynamic mutation)，从而又将这类疾病划属于三核苷酸重复性 疾病(Trinucleotide repeat disease，TRD)范围。由CAG重复扩增致病者又称为 多聚谷氨酰胺疾病(Polyglutamine，polyGln，PolyQs)。不同位点的三核苷酸重复扩 增导致不同的遗传亚型，已经发现25种亚型的脊髓小脑性共济失调。目前的研 究表明不同的国家、地区或种族SCA的发病率、不同亚型的分布有极大的差异。 在大多数国家和地区，SCA3或马查多一约瑟夫病(Machado—Joseph disease，MID) 的比例最高。在我国已经有部分报道，但由于基因诊断水平的限制尚无完整的流 行病学研究报告。 到目前为止，SCA发病确切的分子机制仍然不清，推测包括细胞凋亡、泛 素一蛋白水解酶通路、谷氨酰胺转移酶(Transglutaminase，Tgases)、核酸水平调控 障碍等在内的多个因素与其发病机制有关。有关SCA发病机制的研究是国外神 q》中山丸母 q》 中山丸母 脊髓小脑性共济失调分子遗传学诊断与发病机制研究 经生物学研究的热点之一，而国内尚无有关研究报道。 研究策略、目的： 1、通过EB病毒转化法建立SCA遗传种质库： 2、研究SCA的分子遗传学诊断(基因诊断)方法； 3、分析我国南方人群SCA各基因亚型的分布规律； 4、分析SCA临床表现特征与基因亚型之间的关系； 5、探讨UPP通路在SCA3发病机制中的作用、地位； 6、分析SCA3发病机理中凋亡机制的发生及影响； 7、研究SCA3基因转染PCI2细胞模型基因表达谱的改变(在研)。 方法、结果及结论： 一、脊髓小脑性共济失调分子遗传学诊断 I、EB病毒转化法建立永久淋巴母细胞株，建立SCA遗传种质库； 采用EB病毒孵育全血中的淋巴细胞，促使淋巴细胞转化为具有无限增殖力 的淋巴母细胞样细胞(Lymphoblastoid cell line)，从而可以永久保存遗传物质， 也为研究SCA方便获取眦蝌A以及进一步分子克隆提供条件。 2、SCA的分子遗传学诊断(基因诊断)； 通过对目前基因突变位点明确的基因亚型的PCR扩增，对36个家系43例患 者、38例散发患者、60名家系“健康”个体，以及44名正常对照共185份血标 本进行分子遗传学检测筛查，了解我国南方汉族人群中各型SCA的基本分布规 律大致为：SCA3是最常见的类型，占42％，其余分别为SCA2占7 4％，SCAI 占4．9％，SCA7占3．7％，SCA6占2．4％，SCAl2约占l 2％，未检出SCA8、SCAl0、 SCAl7、DRPLA患者。国内同期发现SCA6、qF型，首次报道SCAl2、S1E型，发现3 个亚型10例症状前患者。 3、SCAI艋床表现特征与基因亚型之间的关系。 根据临床并结合文献，描述了在目前所报道的二十几种SCA亚型中我们所 见到的亚型的基本特征，这对于考虑SCA基因检测的策略有重要意义。 二、脊髓小脑性共济失调分子发病机制研究 l、增强型绿色荧光／ataxin-3融合蛋白真核表达载体的构建； 分别扩增获取pEGFP—C1以及含有全长人SCA3／MJD基因(含有正常 一Ⅱ一 ◇中山丈，_参 ◇ 中山丈，_参 脊髓小脑性共济失调分子遗传学诊断与发病机制研究 CAG28、异常CAG84)的pcDNA3．0质粒DNA，双酶切后将正常及突变的 SCA3／MJD基因插．K．至t|pEGFP．C1多克隆位点，筛选并测序证实其插入序列的正 确性，从而构建成功增强型绿色荧光／ataxin．3融合蛋白真核表达载体。 2、SCA3基因真核表达细胞模型的建立； 培养PCI2(大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞)细胞，给予100ug／L NGF(神经 生长因子)孵育，可见树突状突起。采用脂质体转染DEGF