绿色荧光蛋白在分子生物学研究中的应用【文献综述】.docVIP

毕业论文文献综述 生物技术 绿色荧光蛋白在分子生物学研究中的应用 摘要：绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因一种能发出绿色荧光的新型报告基因，它在蓝光或长紫外光的激发下，不需要任何反应底物及其他辅助因子就能自发地形成绿色荧光，并且能在在细胞内稳定表达。 GFP对受体细胞无毒性，对目的基因没有影响，可以很方便的对活体进行观察，来检测基因的表达。因此，GFP已经成为生命科学领域中研究得最广泛的蛋白质之一。本文就GFP在分子生物学中的应用作简要阐述。 关键词：绿色荧光蛋白；标记；载体 引言 在研究基因的表达调控、信号转导、蛋白运输与定位时常用荧光物质或报告基因作为标记。分泌型胎盘磷酸酯酶(secreted embryo alkaline phosphatase，SEAP)基因、β-半乳糖苷酶(galactosidase)基因、荧火虫荧光素酶(luciferase，LUC)基因是目前常用的一些报告基因，但是它们需要底物和辅助因子，否则不能用于检测，因而在活体中无法更好地应用[1]。绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)是近年发展起来的一种新型的报告基因，它能自发地发出绿色荧光，荧光反应也不是酶反应， 因此受到了广泛的关注[2]。作为报告基因，GFP不需要任何外源性底物和辅助因子，无毒、稳定、无污染，而且可以在紫外或蓝光激发下直接观察[3]。因此，GFP在分子生物学研究中有广阔的应用前景，本文就其在分子生物学的应用做一简要综述。 1 绿色荧光蛋白概述 1.1绿色荧光蛋白的性质 在水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内存在一类生物发光蛋白——绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)[4]。它在紫外或蓝色波长范围的光线激发下，依靠钙离子的帮助能够发出绿色荧光，并在活细胞内稳定表达。GFP的分子量为27kD，由238个氨基酸构成，由11个β片层组成桶状构成疏水中心，第65～67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团，是主要发光的位置。发光的过程中还需要冷光蛋白(Aequorin)的帮助，且这个冷光蛋白与钙离子可产生交互作用，由此产生绿色荧光[5]。它在395nm处具有最大吸收高峰，在475nm处还有一个肩峰[6]。 1.2 绿色荧光蛋白的优点 作为一种新型的标记分子，GFP具有诸多优点而备受关注：(1)便于检测：无需底物和辅助因子提供能源，可被光直接激发；(2)荧光特性稳定：对高温(60℃) 、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂等大多具有较强抗性，对光漂白有较强的耐受性，(3)对细胞或组织无毒害：GFP与目的基因融合后对目的基因的表达没有多大的影响，也不会损害宿主细胞；(4)通用性和共用性：GFP的表达不受宿主范围的限制，也没有细胞种类和部位的限制；(5)分子量小，便于构建载体：与其他序列一起构建载体之后不至于使载体过大影响转化频率；(6)可进行活细胞定时定位观察：能够在细胞和生物体内对目标基因的表达产物进行实时示踪，对高等动物或植物进行转基因标记和体内观察；(7)不受假阳性干扰，灵敏度高：其他生物本身不含有GFP，不会出现假阳性结果，比免疫组织化学方法具有更高的灵敏度和分辨率；(8)易于得到突变体：可通过不同的方法得到GFP的突变体，如荧光强度增加或者颜色改变等；(9)能制成永久标本：光漂白和福尔马林的固定都不容易破坏GFP的荧光，利用这个特点可以制成标本用于长期保存[7-11]。 2绿色荧光蛋白在分子生物学中的应用 2.1用于构建基因工程的表达载体 因为GFP的生物发光无种属组织特异性，所以人们可根据自己的实验目的在不同表达系统中能随意构建表达GFP 的表达载体[12]。陆惠萍等利用绿色荧光蛋白基因(GFP-S65T )构建载体并使其在大肠杆菌中高效表达[13]。沈关心等构建了Wee1Hu与GFP融合基因表达载体，并对其在真核细胞的表达及生物学效应进行研究[14]。Summers等用GFP作为报告基因构建两种转录型的穿梭报告载体并用于丝状蓝藻的研究[15]。Gupta等利用GFP构建载体并使其在大肠杆菌重组突变体中的过量表达[16]。程克棣等构建了能在大肠杆菌中表达融合蛋白的通用表达载体pHis-EGFP，并建立了离子交换层析和亲和层析两步纯化融合蛋白的方法[17]。孙丽萍等构建了人NOD2基因启动子的绿色荧光蛋白表达载体并转染HEK293T细胞，为进一步深入探索NOD2启动子的始动原因及调控机制奠定基础[18]。姜伯乐等将增强型绿色荧光蛋白基因编码序列克隆到不含启动子的载体pLAFR6上，构建报告质粒pLZY，为研究目的基因在不同宿主中的表达和研究植物病原细菌Ⅲ型效应物蛋白的植物亚细胞定位提供了材料[19]。何淑雅等将携带人脆性X相关基