DNA-蛋白质的相互作用.pptVIP

DNA-蛋白质相互作用的研究方法;引言;凝胶阻滞试验 DNaseI足迹试验 甲基化干扰试验 体内足迹试验 酵母单杂交技术 染色质免疫沉淀技术 噬菌体展示技术 核酸适体技术 生物信息学方法 蛋白质芯片技术及纳米技术 ;一、凝胶阻滞试验（DNA迁移率变动试验DNA mobility shift assay）;2 主要步骤及内容： 制备探针DNA （P32放射性同位素标记DNA） 同细胞蛋白质提取物一道温育，形成DNA-蛋白质复合物。 将它加样到非变性的聚丙烯酰胺凝胶中，进行电泳分离。 应用放射自显影技术显现具放射性标记的DNA条带位置 ; 凝胶阻滞试验不仅可以用来鉴定在特殊类型细胞的提取物中，是否存在着能够同某一特定DNA片段结合的蛋白质分子(比如特异的转录因子等)，而且还可以用来研究发生此种结合作用之精确的DNA序列的特异性 ;;材料及试剂： 2X结合缓冲液： 20 mM Tris pH 7.5 、100 mM NaCl、2 mM EDTA、10% 甘油、 poly(dI-dC) (5 mg/ml in TE)、 BSA (10 mg/ml)、 P32-标记探针 缓冲液C： 20 mM HEPES pH 7.9、25% glycerol、420 mM NaCl、1.5 mM MgCl2、 0.5 mM 二硫苏糖醇、0.5 mM 苯甲基磺酰氟化物、0.2 mM EDTA 4%天然的聚丙烯酰胺凝胶(50 ml)：5 ml 40% 丙烯酰胺 (30:1)、2.5 ml 5X 四溴乙烷， 41.95 ml H20、0.5 ml 10% APS（过硫酸铵）、50 ml 四甲基乙二胺、0.25X 四溴 烷电泳缓冲夜。 填充染料： 0.2% 溴酚蓝、0.2%二甲本蓝、50% 甘油 操作步骤： 1.配置反应混合液：探针DNA (1 ng/ml) 0.1ml、 dH20 6.3 ml、2x 结合缓冲液 12.5 ml、BSA (10 mg/ml) 1.0 ml 、 poly(dI-dC) (5 mg/ml) 0.1ml、 2.在细胞提取物中加入缓冲液C至5 ml。 3.加10~15 mg上述溶液（￡ 5 ml)到反应混合物中，总体积应不大于25 ml。 4.在室温下培养20min。 5.加入2.5 ml的填充染料。 6.装载样品到4%的聚丙烯酰胺凝胶柱中。 7.室温下跑电泳2.5h，至溴酚蓝距底部1cm处停止。 8.80℃下干燥凝胶，进行放射自显影处理。 ;二、DNaseI足迹试验(DNaseI footprinting assay) ;如果在电泳时结合DNA化学测序，则可准确判断出结合区 的精确序列。 ;三、甲基化干扰试验; 检测靶DNA中特异G残基的优先甲基化对而后的蛋白质结合作用会有什么效应，从而更加详细地揭示DNA与蛋白质之间的相互作用模式。 DMS化学干扰只能在G和A残基甲基化，不能使T和C甲基化。 故本实验为足迹实验的补充手段。;四、酵母单杂交技术 ;设计含目的基因(称为诱饵)和下游报告基因的质粒并将其转入酵母中; 将文库蛋白的编码基因片段与GAL4转录激活域融合表达的cDNA文库质粒转化入同一酵母中; 若文库蛋白与目的基因相互作用可通过报告基因的表达将文库蛋白的编码基因筛选出来. 注：这里作为诱饵的目的基因就是启动子DNA 片段，文库基因所编码的蛋白就是启动子基因结合蛋白. 酵母单杂交技术广泛用DNA与蛋白相互作用的研究。;不足以充分反映生理条件下，DNA与蛋白质相互作用的真实情况。 因为，高等生物的基因组有染色质结构， 用以上所提到的方法分析得到的某段DNA与蛋白质，在生理状态下， 这段DNA很可能并不与其相对应的因子相结合。 另外，染色质结构本身是动态的，DNA与非组蛋白在生理状态下的相互作用通常是瞬时的， 以上方法难以捕捉到发生在染色质上的基因表达调控的瞬时事件 ;八、染色体免疫沉淀技术Chromatin immunoprecipitation （ChIp）;2、主要步骤及内容;1.细胞的甲醛固定 在1%甲醛的作用下，DNA碱基上的氨基或亚氨基和蛋白质上的氨基包括赖氨酸、精氨酸、组氨酸、色氨酸的侧链氨基与另外的DNA和蛋白质上的氨基或亚氨基交联在一起，在几分钟内形成生物复合体，防止细胞内组分的重新分布。 加入甘氨酸来终止交联反应。 ;2.超声波断裂染色质 甲醛交联后的染色质对限制酶和DnaseI高度抵抗， 因此通常使用超声波使得染色质断裂。 打断后的染色质片段的平均长度应该在500-1000bp左右。 （可以用琼脂糖凝胶电泳来鉴定）;3.氯化铯等密度离心纯化