hedgehog通路介导难治性急性髓系白血病细胞放射线抗拒作用机制及靶向逆转研究内科学血液病专业论文.docxVIP

博士学位论文 博士学位论文 的靶点，但是有关该信号通路与急性髓细胞白血病细胞放射敏感性之间的关系， 以及如何提高放射抗拒白血病细胞放射敏感性的相关研究尚未见报道。因此在 本研究中，我们假设Hedgehog信号通路与难治性急性髓系白血病细胞的放射线 抗拒有关，抑制该通路可以提高细胞的放射敏感性，从而为临床应用提供理论 依据。 研究方法 1．构建放射耐受的HL60／RX细胞：采用小剂量递增诱导照射方法，对HL60 细胞株进行逐渐增加照射剂量，构建放射线抗拒的HL60细胞(HL60／RX细胞)。 将HL60细胞、多药耐药的HL60／AD细胞株作为对照组细胞模型。 2．HL60细胞、HL60／RX细胞和HL60／ADR细胞的放射敏感性比较： 通过克隆形成实验观察细胞对放射线的敏感参数(DO，Dq，SF2)、流式细胞术 检测凋亡率和激光共聚焦显微镜观察y-H2AX方法，比较三种细胞对放射线损伤 的敏感性差异。 3．Hedgehog信号通路介导白血病细胞放射抗拒：为了明确Hedgehog通路 是否介导了白血病细胞的放射线抗拒性，我们首先使用Western blot方法观察三 种细胞中Hedgehog通路关键因子SMO和Gli一1蛋白的表达。然后使用Hedgehog 通路抑制剂——_NvP．LDE225，下调HL60／RX和HL60／ADR两种细胞Gli．1水 平，比较该通路阻滞后细胞放射敏感性变化，计算该药物的放射增敏H：(SER)。 同时使用流式细胞术和激光共聚焦显微镜，分别观察使用抑制剂后放射线诱导 的细胞凋亡率和T-H2AX表达水平。 4．NVP．LDE225通过抑制Gli．1／P13K／AKT／NF．kB途径增加白血病细胞放射 敏感性：为了探讨NVP．LDE225对射线抗拒的白血病细胞放射增敏作用机理， 我们将对射线抗拒的HL60／RX和HL60／ADR细胞分别分为4组：空白对照组、 单用抑制剂组(109mol／1)、单纯照射组(4．8Gy照射)和联合治疗组 (109mol／L+4．8Gy照射)。使用Western blot方法观察各组细胞治疗后Gli-1、 pAKT,NF．kB，Rad5 1，和BAK表达水平；并通过激光共聚焦显微镜观察NF．kB 的核转位情况。 万方数据 中文摘要5．NVP．LDE225对裸鼠移植瘤放射增敏作用：6周龄BALB／c裸鼠在SPF 中文摘要 5．NVP．LDE225对裸鼠移植瘤放射增敏作用：6周龄BALB／c裸鼠在SPF 级环境下饲养，用于构建裸鼠移植瘤模型。常规培养射线抗拒的HL60／RX细胞 和多药耐药的HL60／ADR细胞，以1×1017个细胞／只数量接种于裸鼠皮下，当移 植瘤大小约75—150 mm3作为成瘤标准进行后续实验。将两种细胞的荷瘤鼠分别 随机分为4组：空白对照组常规饲养，单用放疗组使用4．8Gy进行照射，单用药 物组使用NVP．LDE225(80mg／kg／d，每日一次)灌胃处理，联合治疗组使用 NVP．LDE225(80mg／kg／d每日一次)灌胃，48小时后联合4．8Gy照射处理。每 日测量裸鼠肿瘤长短径，按照公式：体积=O．5×长径×短径2计算肿瘤体积。放射 治疗后2周处死荷瘤鼠，手术摘除肿瘤称重，标本放入固定液待用，使用免疫 组化方法研究信号蛋白表达水平。 6．免疫组化观察裸鼠移植瘤Gli．1，NF．kB，p-AKT，和BAK表达：将各组处 理后的肿瘤组织石蜡切片，HE染色观察组织结构并使用免疫组化方法观察各组 Gli．1，NF．kB。P．AKT和BAK表达水平。 7．统计分析：以SPSS 22．0软件进行统计学分析。所有计量资料结果以均数士 标准差表示。两组独立样本比较使用T检验方法，多组资料比较使用单因素方差 分析(ANOVA)。事后多重比较，如方差齐，使用Bonferroni检验；如方差不齐， 则使用Dunnett’S T3检验。尸值0．05认为有统计学差异。 结果 1．成功构建对放射线抗拒的HL60／RX细胞：经过1 2次小剂量递增诱导照射， 在末次剂量4．8Gy照射后，成功构建了放射抗拒的白血病细胞株HL60／RX。克 隆形成实验结果表明，HL60／RX和HL60／ADR细胞对放射线的耐受性明显高于 HL60细胞俨0．001)。HL60细胞的Dq、DO、SF2值为1．134+0．456 Gy, 1．282+0．271Gy和0．345士0．06；HL60／RX细胞的Dq、DO、SF2值为4．513+0．804 Gy,3．033+0．29 Gy和O．814+0．04；HL60／ADR细胞的Dq、DO、SF2值为 3．310+0．677 Gy,2．437+0．259 Gy和0．730+0．04。HL60细胞照射4．8Gy后的细胞