lnRNA调控胃癌转移相关miR7EGFR信号的机制研究.docVIP

IncRNA调控胃癌转移相关miR-7EGFR信号的机制研宄 1南平大学附属第二医院消化内科湖南衡阳421001 2南华大学附属第二医院肝胆内科湖南衡阳421001 第一 刘艳萍(1980-)，女，湖南邵阳人，主治医师，医学硕士，主要从 事消化系肿瘤的防治研究 *通讯 ：李国庆，教授，医学博士，主任医师，硕士生导师 】：目的在胃癌组织中筛查参与调控EGFR和miR-7的IncRNA;探索 IncRNA、miR-7和EGFR的调控网络作用机制；明确该信号网络在胃癌细胞侵袭 转移中的调控作用。方法收集南华大学附属医院3年内经病理证实的胃癌标木 200例，检测miR-7和EGFR表达水平改变;观察miR-7和EGFR表达水平与肿瘤 分期、分化与侵袭转移的关系，两者之间表达的相关性；筛查参与调控miR-7和 EGFR表达的IncRNA。结果观察组与对照组的EGFR蛋白表达阳性率比较，差异 无统计学意义(Pgt;O. 05)。相比较对照组而言，观察组的miR-7表达阳性率 缺失率均较高，组间比较差异具有统计学意义(Plt;O. 05)o结果显示，miR-7 与EGFR在胃癌组织中的表达具有相关性，相关系数为0. 587。结论IncRN A在 恶性肿瘤组织中异常表达的特性，使其成为很好的肿瘤生物标志物，可在肿瘤早 期诊断中发挥重要作用。 关键词】?? IncRNA；胃癌转移;miR-7/EGFR信号；机制研究 】R605.975 】A 】1001-5213(2016)08-0413-02 全球每年新发胃癌934000例，5年生存率不足20%,研宄表明胃癌的 发牛.发展、侵袭转移与细胞内信号网络通路异常有关［1】。长链非编码RNA (long non-coding RNA, IncRNA)是一类转录讼度超过200nt不含起始和终止密码了?的 RNA,因具有较长的一级结构，可作为平台，与其他DNA、RNA相互整合，自身 乂能形成复杂多样的二级空间结构与蛋白因子相互作用而发挥牛.物学功能［2］。 木项目拟釆用高通量测序技术在胃癌组织和癌旁组织筛查参与调控miR-7/EGFR 的IncRNA;并继续扩大临床病例，检测胃癌发生发展过程中EGFR、miR-7和候 选IncRNA的表达并分析相互关系；构建上调和抑制候选IncRNA表达的体外细胞 模型，揭示候选IncRNA介导胃癌细胞侵袭转移的作用机理。 1材料与方法 1.1临床资料 收集南华大学附属医院2011年6月至2014年6月经病理证实的胃癌 标本200例及配对癌旁正常组织。患者术前均未行放、化疗，年龄38-79岁， 中位年龄63岁；组织病理类型的判断参照WHO胃癌的病理学分类标准，TNM 分期参照UICC / AJCC2002年标准。每例标本留取肿瘤组织及对应的距肿瘤5cm 以上的癌旁正常胃黏膜组织（经组织病理切片检测证实），离体后lOmin内置于液 氮中保存待做后续分析。 1.2试剂 Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；DNasel、RNase一free试剂购自美 NI Thermo 公司；ReverTraAce⑧qPCRRTKit、SYBR~GreenRealtimePCRMasterMix 等 购自日本Toyobo公司；CCK 一 8（CellCountingKit - 8）细胞增殖/毒性检测试剂盒 购自日本同仁研究所；人胃癌AGS细胞购自中科院上海细胞库； ArraystarHumanLncRNAMieroarrayV3. 0芯片购自上海康成生物技术有限公司； LncRNAsiRNA和NegativeControl由上海吉玛公司合成；引物由上海英駿生物技术 有限公司合成。 1.3实验方法 1.3.1总RNA的提取 取液氮保存的胃癌组织及癌旁正常胃黏膜组织标本，在液氮中碾碎至 粉状，按Trizol试剂说明书提取总RNA，DEPC处理过的蒸馏水溶解。为去除可能 污染的DNA,抽提的RNA溶液按DNasel说明书步骤进?一步纯化。采用 NanoDrop2000超微量分光光度计（美国Thermo公司）检测RNA溶液OD260 / OD280,计算RNA浓度和纯度，琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。 1.3.2免疫组织法 运用10%中性福尔马林对标本进行固定，石蜡常规包埋，制作成 4mu;m切片，常规HE染色，将细胞状态较好的切片作为研究对象。运用SP法 对所有标本进行免疫组织化学检测，在同一条件下，严格按照SP免疫组织法对 标本进行染色，DAB显色，并将己知的miR-7、EGFR蛋白染色阳性组织切片作为 阳性对照组，而PBS取代一抗则为阴性对照。 判断标准：随机选取每张切片的5个高倍镜下视野，对细胞染色强度 进行仔细观察并记录结果：0分为细胞不着色；1分为浅黄色；