孕早期应用地塞米松对羊胎盘糖皮质激素受体作用.docVIP

孕早期应用地塞米松对羊胎盘糖皮质激素受体作用 　　[摘要] 目的 通过观察羊胎盘糖皮质激素受体的变化，研究孕早期应用地塞米松对羊胎的影响。 方法 2005～2009年将108只羊随机分为对照组（生理盐水2 mL）和地塞米松组（地塞米松0.14 mg/kg肌注），应用免疫组化和western blot方法分析GR的表达。于孕50、100、125、140 d收集胎盘。 结果 在孕50 d和125 d的雌性羊胎，地塞米松增加了总GR蛋白表达量，但在孕125 d的雄性羊胎，地塞米松降低了总GR蛋白表达量。DEX没有改变GRα蛋白表达量。根据GRα的表达发现三种双核细胞亚型（++，+-，- -）。 结论 DEX对胎盘的作用是性别依赖的。DEX改变了胎盘对内源性糖皮质激素的反应。BNC的总体活力可能取决于三种亚型的分布比例。 　　[关键词] 地塞米松；胎盘；糖皮质激素受体；双核细胞；性别依赖 　　[中图分类号] R715.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）33-0028-04 　　对有早产迹象的孕妇应用合成糖皮质激素能显著降低新生儿死亡率和呼吸窘迫综合征发生的可能性[1，2]。在孕早期，糖皮质激素还可以应用于先天性肾上腺皮质增生症的治疗[3]。虽然现在已经有很多关于孕晚期应用糖皮质激素的研究，但仍缺乏关于孕早期应用糖皮质激素的治疗相关研究。双核细胞（BNC）是羊胎盘滋养细胞中具有分泌功能的细胞，能够分泌胎盘生乳素，从而对胎儿的生长发育起到重要作用[4]。糖皮质激素的作用需要通过糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor，GR）的介导[5]。GR有2个亚型，分别为GRα和GRβ。GRα是配体依赖性亚型，被认为是功能型受体，而GRβ为非配体依赖性，可能对GRα起到调节作用[6]。本研究观察羊孕早期应用地塞米松对GR的分布和GR蛋白表达量的影响。我们假设糖皮质激素的作用是性别特异性。 　　1 材料与方法 　　1.1 一般资料 　　所有实验都经过伦理委员会的批准。在2005年1月～2009年12月期间怀有单胎的108只羊被分为对照组（n=59）和地塞米松组（DEX组，n=49）。对照组于孕50 d、100 d、125 d和140 d予2 mL的生理盐水，DEX组则予0.14 mg/kg 的地塞米松（H02AB02，Mayne Pharma，Australia）肌注，每12小时一次，共4次。此后取出羊胎盘，并放入液氮中速冻保存，或放入福尔马林溶液用于制作病理切片。 　　1.2 GRt、GRα和GRβ的定位 　　使用免疫组织化学染色GRt、GRα和GRβ。用兔抗人GRt抗体（MA1-510，Thermo Scientific，USA），浓度为1∶50或兔抗人GRα抗体（P-20：sc1002，Santa Cruz，USA），浓度为1∶100或兔抗人GRβ抗体（PA3-514，Thermo Scientific，USA），浓度为1∶100孵育24 h后，再用抗兔二抗（PK-4001 Vectastain ABC kit，Vector Laboratories，USA），浓度为1∶200孵育1 h。共设置3组阴性对照组：①仅使用一抗孵育；②仅使用二抗孵育；③仅用稀释液孵育。 　　1.3 GRt、GRα和GRβ的蛋白定量 　　取80 mg胎盘组织放入裂解液中，在冰上用电动匀浆器充分匀浆，12000×g，4℃低温离心15 min，收取蛋白。取80 μg蛋白加上5×上样缓冲液煮沸10 min。在6%SDS凝胶上进行电泳后湿转至PVDF膜上，再用5%牛奶封闭1 h。将一抗稀释（GRt 1∶1000，GRα 1∶200，GRβ 1∶200）过夜孵化；PBS-T漂洗后按1∶1000比例稀释二抗，室温孵育1 h。应用ECL发光液（32209，Thermo Scientific，USA）显影后用凝胶成像仪成像。显影完毕后，彻底冲洗，按之前步骤孵育多克隆β-actin一抗（107K4800，Sigma，USA）抗体浓度1∶20000，二抗使用HRP标记的山羊抗兔IgG（1∶20000，31458，Thermo Scientific，USA），再次显影、成像。使用Quantity One软件分析灰度比值，从而得出GRt、GRα和GRβ的蛋白相对表达量。将GRt的电泳条带切下后送专业公司进行蛋白结构分析。GRα和GRβ的蛋白特异性用公司配套的特异性阻断剂检验（GRα阻断剂：sc-1002 P，Thermo Scientific，USA；GRβ阻断剂：PEP-222，Thermo Scientific，USA）。 　　1.4 统计学分析 　　采用SPSS13.0统计学软件，正态分布变量以（x±s）