第六章-分子生学研究法.pptVIP

第三节 蛋白质及RNA相互作用技术 3. 体外蛋白质相互作用技术 免疫共沉淀技术 将靶蛋白的抗体连接到固体基质上，再将可 能与靶蛋白发生相互作用的待筛选蛋白加入 反应体系中，用低离心力沉淀或微膜过滤法 在固体基质和抗体的共同作用下将蛋白复合 物沉淀到试管的底部或微膜上。 * * * * 第三节 蛋白质及RNA相互作用技术 4. 细胞内蛋白质相互作用研究——荧光共振能量转移法（FRET） FRET荧光能量转移有三个基本条件： 给体与受体在合适的距离（1～10 nm）； 给体的发射光谱与受体的吸收光谱有 一定的重叠（这是能量匹配的条件）； 给体与受体的偶极具有一定的空间取 向（这是偶极-偶极耦合作用的条件）。 * * * * 第三节 蛋白质及RNA相互作用技术 5. RNAi（RNA干涉）技术及其应用 RNAi技术利用双链小RNA高效、特异性降解 细胞内同源mRNA从而阻断靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。RNAi的命名来源于安德鲁·法尔1998年在《自然》杂志上的 论文。 研究发现，双链RNA是RNAi的触发物，引 发与之互补的单链RNA（ssRNA, single- stranded RNA）的降解。 经过Dicer（一种具有RNAase III活性的核酸 酶）的加工，细胞中较长的双链RNA（30个核苷酸以上）首先被降解形成21～25个核苷 酸的小分子干扰核糖核酸（siRNA，short interfering RNA ），并有效定位目标 mRNA。 * * * * * * RNAi作用机 制示意图。 第三节 蛋白质及RNA相互作用技术 5. RNAi（RNA干 涉）技术及其应用 siRNA是引发转录后基因沉默中序列特异性 RNA降解的重要中间媒介，它具有特殊的结 构特征，即5’端磷酸基团和3’端的羟基，其 两条链的3’端各有两个碱基突出于末端。 由siRNA中的反义链参与指导合成被称为 RNA诱导的沉默复合体（RISC）的核蛋白 体，再由RISC介导切割目的mRNA分子中与 siRNA反义链互补的区域，从而实现干扰靶 基因表达的功能。 * * * * 第四节 基因芯片及数据分析 基因芯片及数据分析 基因芯片（DNA chip），又称DNA微阵列 （DNA microarray）技术是能同时监测大量靶 基因表达的实验手段，从而迅速准确地在基因组水平上阐述不同生物组织或细胞中各种转录 本的变化规律。 * * * * * * 基因芯片及数据分析 简易基因芯片 使用机械臂把DNA片段点在玻璃片或尼龙膜 上，经过物理吸附作用达到固定化。也可以 直接在玻璃板表面进行化学合成，从而得到 寡聚核苷酸芯片。将芯片与待研究的cDNA 或其它样品杂交，经过计算机扫描和数据处 理，便可以观察到大规模的基因群在不同组 织或同一组织不同发育时期或不同生理条件 下的表达模式。 基因芯片可用于进行基因诊断。先建立正常人 特定组织、器官的基因芯片，给出标准杂交信 号图，用可疑病人的cDNA做探针与之杂交，确 定哪些基因的表达受抑制或激活。 * * 第五节 其他分子生物学技术 1. 凝胶滞缓实验 凝胶滞缓试验（gel retardation assay）， 又叫作DNA迁移率变动试验（DNA mobility shift assay），是用于体外研究DNA与蛋白质 相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。 在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA 朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反 比。如果此时DNA分子与某种蛋白质相结合， 那么，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作 用便会受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电 极移动的距离也就相应缩短了。 * * * * 第五节 其他分子生物学技术 拟南芥转录 因子与不同 DNA元件有不同的结合能力。 * * * * 第五节 其他分子生物学技术 2. 噬菌体展示技术 噬菌体是细菌病毒的总称，英文为 Bacteriophage，来源于希腊文“phagos”， 有“吞噬”之意。 噬菌体可被分为溶菌周期和溶源周期两种不同 的类型。在溶菌周期，噬菌体将其感染的宿主 细胞转变成为噬菌体的“制造厂”，产生出大量 的子代噬菌体颗粒。实验室常将只具有溶菌生 长周期的噬菌体叫作烈性噬菌体。 溶源生长周期是指噬菌体DNA被整合到宿主细胞染色体DNA上，成为它的一个组成部分，感染过程中不产生子代噬菌体颗粒。具有这种溶源周期的噬菌体被称为温和噬菌体。 * * * * 噬菌体展示技术的基本原理是将编码“诱饵”蛋 白的DNA片段插入噬菌体基因组，并使之与噬 菌体外壳蛋白编码基因相融合。重组噬菌体侵 染宿主细菌后，复制形成大量带有杂合外壳蛋 白的噬菌体颗粒，直接用于捕获靶蛋白库中与 “诱饵”相互作用的蛋白质。 * * * * 第五节