第八章-基诊断与治疗.ppt

乳腺癌 乳腺癌是女性最常见的肿瘤之一，癌基因neu与乳腺癌的预后紧密相关。癌基因neu明显扩增的乳腺癌患者术后复发和转移率高，因而neu可作为判断乳腺癌预后的一项重要指标。 以待检的DNA片段或cDNA片段作为探针，采用适当的限制酶或机械剪切法，将乳腺癌细胞的基因组DNA制备成大小适当的片段，进行Southern blotting分析。如果neu基因的拷贝数发生了改变，杂交后显示的条带位置会发生改变。 也可以用Northern blot方法对乳腺癌细胞中的RNA进行检测和分析。 五、基因诊断在法医中的应用 法医学鉴定的分子基础 （一）、重复序列多态性与DNA指纹 人类基因组DNA序列，除非同卵双生，几乎没有任何两个人的DNA分析图谱会完全相同，这就像人的指纹那样，因而被称为DNA指纹(DNA fingerprint)，它是个体识别的有力依据。 人基因组中有大量数目可变的串联重复序列(variable number of tandem repeats，VNTR)，可分为小卫星、短串联重复(STR)和微卫星三种形式。VNTR位点的平均杂合度在70％左右，在基因组中的存在极为广泛，分布也十分理想，并且检测手段简便，所以在短短的几年中取代了RFLP而成为构建连锁图谱的新标记。 PCR技术和荧光序列自动分析技术的应用大大促进了VNTR的研究，自1988年至今，法国的人类多态性研究中心(Center d’Etudes du Polymorphism Human,CEPH)等几个机构报道，已有5264个(CA)。 二核苷酸微卫星标记被定位于人类23条染色体的2335个位点，形成了第二代高分辨率的基因组物理图谱，对人类基因组计划的开展起到了直接的推动作用。 由于VNTR具有高度多态性和高杂合度，因此用少数几个高度多态性的标记就可以建立高精度的“DNA指纹”，多个这样的标记形成的“DNA指纹”几乎在人群中不存在重复。同时，由于多态性标记突变率低，并且以孟德尔方式遗传，因而分析一个或几个标记就可以鉴定亲子关系 微卫星DNA/小卫星DNADNA指纹鉴定法: 针对重复序列人工合成寡核苷酸短片断作为探针，与经过酶切的人基因组DNA进行Southern杂交，可以得到大小不等的杂交带，而且杂交带的数目和分子量大小具有个体特异性，就像人的指纹一样，因而把这种杂交带图谱称为DNA指纹或基因指纹 结合PCR更为有力。 DNA指纹的特点： 1、可同时检测多位点的变异 2、具有高度特异性 3、具有稳定的遗传性 4、具有体细胞稳定性 （二）、DNA指纹与法医鉴定 个体识别 亲子鉴定 第三代DNA多态性标记系统 —单核苷酸多态性(SNP) 某些DNA位点上，单个碱基存在着变化。如： AATGGCGTAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCAGCT AATGGCCTAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCTGCT AATGGCATAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCGGCT 个体A 个体B 个体C SNP分布于整个基因组，可在基因内，也可在基因间。估计每1000个bp存在一个。在人类DNA序列变异中，SNP占90%。 单个碱基的插入和缺失不认为是SNP。目前已知基因组中含有150万个SNP RFLP：碱基的变异就可能导致酶切点的消失或新的切点出现，当使用同一限制酶切割不同个体基因组DNA时，DNA片段长度出现差异，这种由于内切酶切点变化所导致的DNA片段长度的差异，称为限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism, RFLP）。 RFLP反映了常见的个体间DNA核苷酸的可遗传性变异，它按照孟德尔方式遗传。RFLP可用Southern印迹杂交法检出。 多态性位点：能导致限制性片段发生改变的酶切位点。 DNA－PCR扩增包含多态性位点的序列－限制性内切酶酶解－电泳分析 当重要DNA多态性位点周围的DNA序列已知时，应用PCR方法可以简便地知道家庭成员中这些多态性位点的存在和丢失，通过连锁分析，即可对有遗传病危险的胎儿进行产前诊断和携带者检测。这称为PCR／RFLP连锁分析法。 2、DNA重复序列多态性分析 小、微卫星DNA(Micro-satellite DNA)属高度重复序列, 由于重复单位的数目不同而形成多态性呈现孟德尔式遗传 TTCAGCTAGCTCAGCAGCAGCAGCAGCAGAGCTTGC AAGTCGATCGAGTCGTCGTCGTCGTCGTCTCGAACG 常用检查方法：PCR等。 微卫星DNA PCR扩增结果（示例）： 500bp 400bp 300bp 240bp 该结果显示在所检查的人群