DNA依赖蛋白激酶和检查点激酶1对卵巢癌细胞周期阻滞研究.docVIP

DNA依赖蛋白激酶和检查点激酶1对卵巢癌细胞周期阻滞研究 　　【摘要】 目的：探讨DNA-PK和CHK1对卵巢癌Skov3的细胞周期阻滞的机制。方法：通过对DNA-PK shRNA和CHK1 shRNA的构建及有效干扰载体的筛选，流式细胞仪检测G2期。结果：转染DNA-PK shRNA的Skov3细胞和Hela细胞经2Gy X射线照射后进入G2期的细胞比率无差异；转染CHK1 shRNA的Skov3细胞经2Gy X射线照射后4h进入G2期的细胞比率显著高于Hela细胞（t=2.618，P=0.026），28h时明显低于Hela细胞（t=2.705，P=0.022）；转染DNA-PK shRNA和CHK1 shRNA的Skov3细胞经2Gy X射线照射后4h进入G2期的细胞比率显著高于Hela细胞（t=2.965，P=0.014），28h时明显低于Hela细胞（t=2.302，P=0.044）。结论：干扰DNA-PK和CHK1的表达可增强卵巢癌细胞对辐射的敏感性。 　　【关键词】 辐射敏感性； 卵巢癌； DNA依赖的蛋白激酶； 检查点激酶1 　　卵巢癌（ovarian cancer）是女性生殖系统常见的三大恶性肿瘤之一，死亡率居妇科恶性肿瘤之首。由于卵巢位于盆腔深处，比较隐蔽，使得早期卵巢癌患者缺乏特异的临床症状和有效的检测手段[1，2]，因此，绝大多数患者在明确诊断时肿瘤已经发生转移，严重威胁着妇女的生命健康[3，4]。本研究以shRNA干扰DNA-PK和CHK1在卵巢癌Skov3细胞和宫颈癌Hela细胞中的表达，观察其2Gy照射后细胞周期变化及其ATM信号传导途径中DNA依赖的蛋白激酶（DNA-dependent protein kinase，DNA-PK）和检查点激酶1（checkpoint kinase ，CHK1）等分子表达的变化，探讨其辐射敏感性差异的机制。 　　1资料与方法 　　1.1主要试剂和仪器 　　pGPU6/GFP/Neo购于上海吉玛制药技术有限公司；BbsⅠ、BamHⅠ、PstⅠ、T4 DNA ligase、MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver3.0、MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver3.0 、E.coli Competent Cells JM109购于日本TaKaRa；Anti-human DNA-PK、Anti-human CHK1购于英国Abcom公司；LipofectamineTM 2000购于Invitrogen。Philip深部X射线治疗机、美国BD公司FACScan流式细胞仪、AnnexinⅤ–FITC细胞凋亡检测试剂盒。 　　1.2方法 　　1.2.1寡核苷酸的设计、合成根据人DNA-PK和CHK1在GenBank登录号HSU34994、AF016582，选择CDS区，应用shRNA设计软件，选择DNA-PK和CHK1干扰RNA的靶点，设计shRNA。在shRNA中的loop结构选择TTCAAGAGA，避免终止信号的形成，转录终止信号选用T6结构。shRNA正义链的5’端添加CACC序列，与BbsⅠ酶切后形成的粘末端互补；反义链的5’端添加了GATC，与BamHⅠ酶切后形成的粘末端互补。如果siRNA的第一个碱基不是G，则在CACC序列后补加一个G。 　　1.2.2寡核苷酸的退火将合成的DNA oligo用TE（pH8.0）溶解，调整浓度为100 μM。取相应的正义链和反义链oligo溶液。配制反应体系：10×shDNA Annealing Buffer 5μl、sense strand （100 μM）5μl、antisense strand （100μM） 5μl、ddH2O 35μl、Total 50μl。退火条件：95℃ 5min、85℃ 5min、75℃5min、70℃5min，4℃保存。退火反应后得到浓度为10μM的双链oligo DNA，将其稀释500倍，使终浓度为20 nM。 　　1.2.3载体构建、酶切、鉴定、测序pGPU6/GFP/Neo-shRNA载体线性化、琼脂糖凝胶回收、双链oligo DNA与线性载体连接、JM 109感受态细胞转化、质粒提取。酶切反应体系：重组质粒1μg、10×Buffer 2μl、BamHⅠ or PstⅠ1μl、ddH2O To 20 μl，37℃酶切1h，1%琼脂糖凝胶电泳，检测酶切结果。选取阳性重组质粒测序（上海英骏生物技术有限公司），应用NCBI上的Align two （or more） sequences using BLAST （bl2seq）软件分析所测得的序列。 　　1.2.4照射条件将细胞以3×105个/孔接种于