贵州野生淡黄花百合RAPD反应体系建立.docVIP

贵州野生淡黄花百合RAPD反应体系建立 　　摘要：以贵州林下野生淡黄花百合（Lilium sulphureum Baker）幼嫩叶片为材料，采用改良的CTAB法提取百合基因组DNA，得到了较高质量的DNA。并对影响随机扩增多态DNA性（RAPD）反应的主要因素进行了优化，建立并优化了野生淡黄花百合的RAPD反应体系及程序。优化的20 μL反应体系中包含20 ng模板DNA，2.0 mmol/L Mg2+、0.25 mmol/L dNTPs、1.0 U Taq DNA聚合酶、10×Buffer 2 μL、0.4 μmol/L随机引物、ddH2O补足至20 μL。优化的RAPD扩增程序为94 ℃ 3 min；94 ℃ 50 s，37 ℃ 40 s，72 ℃ 80 s，40个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。该反应体系具有较好的稳定性及可重复性，适合贵州野生淡黄花百合遗传多样性研究。 　　关键词：淡黄花百合（Lilium sulphureum Baker）；DNA提取；RAPD 　　中图分类号：Q523 文献标识码：A 文章编号：0439—8114（2012）19—4393—03 　　百合又名夜合、中蓬薯、蒜脑薯、强瞿等，素有“球根花卉之王”???美誉[1]，系百合科（Liliaceae）百合属（Lilium）植物[2，3]，其用途广泛，具有药用、食用、观赏价值，是中国卫生部审批通过的首批药食两用植物[4]。中国是百合属植物自然分布的中心，分布有55种及18个变种[5，6]。但目前大部分百合栽培品种非中国育成，开发中国百合野生种质资源，对培育高质量新品种百合具有非常重要的意义[7]。贵州省地理环境复杂多样，野生百合资源丰富，其中淡黄花百合（Lilium sulphureum Baker）分布广泛，是贵州省食品企业制作百合粉的主要原料[8]。为更好地开发利用和保护贵州省的野生百合资源，本实验以淡黄花百合为材料，探讨适合于贵州野生百合的RAPD反应体系，为进一步分析贵州野生百合遗传多样性及亲缘关系奠定基础。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料与仪器 　　野生淡黄花百合采自贵州务川县野生林下，2011年种植于遵义师范学院生物系植物园地内，待萌芽后采集新鲜幼嫩无病虫害的叶片于封口袋（100 mg/袋），置冰盒中带回实验室，—80 ℃超低温冰箱保存备用。 　　Taq DNA聚合酶、dNTPs、DL 2 000 Marker、琼脂糖、CTAB等均购自天根生化科技（北京）有限公司；引物（S1027，ACGAGCATGG）购自上海捷瑞生物工程有限公司；氯仿、异戊醇、无水乙醇、EDTA、异丙醇等试剂均为国产分析纯。PCR仪、凝胶成像仪均为美国伯乐公司产品，电泳仪购自北京六一仪器厂。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 淡黄花百合基因组DNA的提取 采用改良的CTAB法提取淡黄花百合基因组DNA[9]。取200 mg百合叶片，液氮研磨至粉末，置于2 mL离心管中，加入600 μL 65 ℃预热的2%CTAB提取液，65 ℃水浴30 min，其间每隔10 min轻轻颠倒离心管1次；然后加入等体积的酚—氯仿—异戊醇（体积比25∶24∶1，下同）混合液混匀，12 000 r/min离心10 min；取上清液，用酚—氯仿—异戊醇试剂再抽提1次，12 000 r/min离心10 min，取上清液；加入700 μL预冷的异丙醇，轻轻混匀，12 000 r/min离心10 min，可见白色沉淀；用体积分数75%的乙醇漂洗沉淀，弃上清，在干净吸水纸上倒置离心管，去除残留的乙醇，溶于60 μL TE中，4 ℃冰箱过夜溶解，—20 ℃保存。 　　1.2.2 DNA的检测 用紫外分光光度计测定百合DNA在260 nm和280 nm波长下的吸光度，依据A260 nm/A280 nm判断所提取DNA的纯度。取5 μL百合DNA样品进行1.2%琼脂糖凝胶电泳（5 V/cm、1 h），在凝胶成像仪上观察并拍照。 　　1.2.3 RAPD反应条件优化 随机选取6个贵州野生淡黄花百合样本进行扩增。RAPD反应体系为20 μL，设置单因素实验分别对模板DNA用量（10、20、40、60、80 ng）、Mg2+浓度（1.50、1.75、2.00、2.25、2.55 mmol/L）、dNTPs浓度（0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mmol/L）、Taq DNA聚合酶用量（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 U）、随机引物浓度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μmol/L）及RAPD反应程序中的退火温度（35、36、37、38、39 ℃）、循环次数（25、30、35、40、45）等影响因素进行考察，找出适合于贵州野生淡黄百合RAPD反应的条件。扩增