第五章 基因的分离与鉴定PPT.ppt

基本过程： 1. 从一对处于不同发育阶段（或不同基因型） 的细胞群体中分离总mRNA，并用3’-端锚定引物作反转录合成第一链cDNA; 2.用5’-端随机引物和3’-端锚定引物组成的引物对，在加入放射性同位素标记的dNTP的条件下，以第一步反转录产物作模板进行PCR扩增。 3.将扩增样品在变性的DNA测序胶中进行电泳分离； 4.将有关的差别表达的DNA条带从测序胶上切割下来回收其DNA片断； 5.胶块中的DNA量非常少，不能用于克隆，需进行二次扩增； 6.将克隆的特定的DNA分别同基因组DNA及总mRNA作Southern或Northern杂交，测序； 7.以此目的片断作探针从cDNA文库中或基因组文库中筛选全长的cDNA克隆或基因组克隆。 优点： 1.可以同时比较多个样品表达的差异； 2.可以同时检测“上游”及“下游”的基因； 3.检测灵敏度高，所需样品少，经PCR扩增一些低峰度的mRNA也可以被检测出来； 4.结合使用了PCR和序列胶电泳分析两项技术，使本方法显得较单方便。 局限性： 1.假阳性比例高（50%～75%）； 同一长度的条带，含有多种DNA序列；邻近条带回收时，造成人为误差； mRNA3’-端序列保守性高，而常用3’-端cDNA作探针。 2.扩增的差别条带分子长度比较短小（110～450bp）； 应用表达文库 分离克隆的目的基因 表达文库分离克隆的目的基因 当没有可用的核苷酸序列供作筛选基因文库的探针时，将cDNA克隆在表达载体上，再导入大肠杆菌寄主细胞然后通过对蛋白质产物的鉴定，分离克隆的真核目的基因。 在拟南芥和番茄中1cM的图距大约相当于290 kb和750 kb，而在人类基因组中1cM的图距大约相当于1 000 kb，在小麦中这个数字是3 5000 kb。 由于大多数高等真核基因组中都存在着大量的散在重复序列，致使染色体步移对于超大型的DNA序列的作图和超长的距离进行基因定位克隆存在一定的困难。 大尺度基因组物理图谱的构建 1. DNA分子大片断切割 2. 大片断DNA分子的分离 3. YAC库的构建 4. 大尺度物理图谱的构建 DNA分子大片断切割 用切割位点稀少的核酸内切酶进行切割。 大片断DNA分子的分离 脉冲电场凝胶电泳（PFGE） YAC库的构建 YAC（yeast artificial chromosome，酵母人工染色体）质粒载体是在人类基因组计划（HGP）实施的背景下发展起来的一类克隆特大片段的载体。 这类载体含有 1. 酵母菌的复制起点ARS（automatic replication sequence,ARS）， 2. 来自酵母染色体的着丝粒CEN（centromere）序列； 3. 一对酵母的端粒TEL（telomere）序列； 4. 选择性标记和克隆位点； 5. 同时还含有大肠杆菌的复制起始点，可以在大肠杆菌中以环状质粒的形式存在。 DNA体外重组后以原生质体转化的方式导入酵母细胞。 这类载体克隆能力可达1~2Mb。主要用于基因组文库的构建。 大尺度物理图谱的构建 物理图谱（physical genes）:分子标记间的物理图距是以核苷酸数目表示的，这种图谱现在可以PFGE法进行构建。通过测定携带分子标记的DNA限制片断的大小，便可以计算出两个分子标记之间的物理图距。 构建全基因组物理图谱的过程 分离到大量的基因组克隆，并构建它们的详细的限制图谱，就可以鉴定出重叠的基因组克隆，进而构建出全基因组的物理图谱。 克隆基因的分离 1.应用核酸探针 2.应用差别杂交或扣除杂交法 3.应用mRNA差别显示技术 4.应用表达文库 5.酵母双杂交体系 应用核酸探针 分离克隆的目的基因 步骤： 1.获得探针 2.转膜 3.杂交 Transfer the DNA in the plaque or colony to a Nylon or nitrocellulose membrane Phage DNA bind to the membrane directly Bacterial colonies must be lysed to release DNA on the membrane surface. Hybridization (in