第五章 基因克隆的载体PPT.ppt

M13单链DNA的复制型（RF，replicative form）是呈双链环形，此时的DNA，不会插入细菌基因组，持续复制，当积累到100-200个拷贝后，噬菌体DNA编码的正链特异结合蛋白很快就阻止了负链的进一步生成，但以负链为模板的正链合成并未受到影响。大量游离的正链DNA很快参入到外壳蛋白中形成了大量新的噬菌体颗粒。 M13噬菌体的特点 感染Ecoli后，在宿主细胞内会形成双链的复制型ＤＮＡ（ replication form DNA, RF DNA）。可以象质粒ＤＮＡ那样在体外进行纯化和操作。 成熟的噬菌体颗粒仅能感染E.coli的F+细胞，这是因为这种噬菌体的感染位点在性散毛上。但是无论是RF DNA或ss DNA都能转染E.coli的F+或F-细胞。 噬菌体颗粒的大小是受其ＤＮＡ的大小制约的，这一点正好与λ噬菌体相反。所以M13噬菌体并不存在包装限制的问题。 M13噬菌体的特点 M13单链DNA噬菌体的生命周期 Phage M13 replication in the host cell: + RNA pol DNA polIII ± RF Nicked by gene 2 protein + ss-Rolling circle replication, then cut and ligate Coated with gene 5 protein Gene 5 protein is replaced by gene 8 protein ect. Linear M13 phage released from the cell. 具有多克隆位点(MCS)，方便克隆。许多M13载体的多克隆位点与质粒载体pUC序列的多克隆位点是相同的，在克隆位点选择上更为方便。 可以定向地克隆DNA片段，克隆在M13 RF DNA分子上的双链DNA片段，到了子代噬菌体便成了单链的形式。所以如果要同时分离ＤＮＡ分子中的双链，则需要两种独立的克隆。根据M13的生物学特性知道，M13子代噬菌体中总是只含有（＋）链，所以M13载体克隆的外源DNA片段在子代噬菌体中究竟是含有DNA分子中的哪条链，则完全取决于外源ＤＮＡ克隆时的取向。这样一来，为分别分离外源ＤＮＡ分子的两条链带来一定的麻烦，解决这一问题的一个行之有效的方法就是定向克隆技术。 M13载体 1. 在这类载体的基因组中有一条饰变的β-半乳糖苷酶基因片段（Hind?片段），其中插入了一段具有密集的多克隆位点的序列； 2. M13载体系列是应用基因工程技术成对地构建的，可有效地克隆双链DNA分子中的每一条链。 M13载体系列的优点 M13克隆载体分子结构图 Ⅳ、噬菌粒载体 由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型的载体系列。 它具有质粒的复制起点、选择性标记、多克隆位点等，方便DNA的操作，可在细胞内稳定存在；又具有单链噬菌体的复制起点，在辅助噬菌体的存在下，可进行噬菌体的繁殖，产生单链的子代噬菌体。 噬菌粒载体 具有较小分子量的共价、闭合、环形的基因组DNA，可克隆10kb的外源DNA片段，并易于进行分离与操作； 编码一个ampr基因作为选择记号，因此只有携带pUC118或pUC119噬菌粒载体的大肠杆菌转化子细胞，才能够在含有氨苄青霉素的培养基中生长，便于转化子的选择； 拷贝数含量高，每个寄主可高达500个，所以只要用少量的大肠杆菌细胞培养物，便可制备出大量的载体DNA； 存在着一个多克隆位点区，因此许多种不同类型的外源DNA片段，不经修饰便可直接插入到载体分子上； 常用的噬菌粒载体 pUC118和pUC119 由于多克隆位点区阻断了大肠杆菌lacZ基因的5’-端编码区，可按照IPTG组织化学显色反应试验，筛选重组子； lacZ基因是置于lac启动子的控制之下，这样插入的外源基因便会以融合蛋白质的形式表达； 含有质粒的复制起点，在没有辅助噬菌体的情况下，克隆的外源基因可以像质粒一样按常规的方式，复制形成大量的双链DNA分子 带有一个M13噬菌体的复制起点，在有辅助噬菌体感染的寄主细胞中，可以合成出单DNA拷贝，并包装成噬菌体颗分泌到培养基中； 常用的噬菌粒载体 pUC118和pUC119 在pUC118和pUC119这两个载体中，多克隆位点区的核苷酸序列取向是彼此相反的，于是它们当中的一个可转录克隆基因的正链DNA，另一个则可转录出负链DNA； 可以直接对克隆的DNA片断进行核苷酸的序列测定，免去了从质粒载体到噬菌体的这一烦琐的亚克隆步骤。 常用的噬菌粒载体 pUC118和pUC119 溶源噬菌体的诱发： 依赖于阻遏基因与操纵基因的相互作用。阻遏物被一种蛋白酶切割，失活，使噬菌体转录。 需要删除酶（excisiona