第五章 微生物药物产生菌的菌种选育PPT.ppt

S. avermitilis可产生抗寄生虫药物多组份的阿维菌素(avermectin)，其中B1是主要的活性成分。Ikeda等使用诱变技术获得了仅产B组份(B1a, B2a, B1b, B2b)的变株K2024, 和仅产A组份(A1a, A2a, A1b, A2b)的变株K2021。将这两亲本进行原生质体融合后，获得了只产B1a和 B2a 组份的融合株 K2038。 B. 阻断代谢旁路，增加有效成分的产量或改善组份的构成 进一步，他们利用转座子突变技术选择性地敲除 S. avermitilis 中毒性化合物寡霉素的生物合成基因，所得菌株只产生阿维菌素。 Formation of CHC-CoA in S. collinus Genetic organization of the genes for the biosynthesis of CHC unit C. 合理地设计产生有价值的天然产物的衍生物的生物合成旁路 CHC unit is used for the biosynthesis of Doramectin 不足之处 不能提供或很少提供某些产物合成所需的前体物质 没有翻译后修饰 D. 构建能产生中间体或前体的基因工程菌 大肠杆菌(E. coli)是最常使用的表达系统:生长迅速(菌体倍增约为20分钟)，发酵设备简单，提取纯化容易，工艺成熟。 6-dEB为 Sac. erythraea 产生的红霉素的前体，原株中产量低 Sac. erythraea 和 E. coli相比较，发酵过程难以扩大化，菌体倍增时间长(4小时), 发酵和生产工艺需严格控制。 大肠杆菌系统中表达DEBS产生6-dEB 如何表达正确折叠和翻译后修饰的PKS。催化表达产生6-dEB的巨大的DEBS蛋白为两个相同的28个活性位点a2b2g2的二聚体, 有7个必需磷酸泛酰乙胺化的残基。E. coli 没有保证ACP的活性的磷酸泛酰乙胺化酶。 组成部件必需在E. coli 中有供应。6-dEB是由1个丙二酰CoA和7个(2S) -甲基丙二酰CoA (2S-mmCoA)作为骨架所组成的。E. coli 没有 (2S)- mm CoA 。 为保证产生有效的细胞内产生6-dEB的系统，DEBS在胞内的活力必须与前体的生物合成相适应, 以对相关的立体化学和动力学参数进行最优化。 产6-dEB的工程菌E. coli BAP1的构建 基 因 来 源 备注 Three DEBS genes Sac. erythraea 插入 Sfp (phosphopantetheinyl transferase) B. subtilis 插入 Propionyl-CoA carboxylase S. coelicolor 插入 prpRBCD genes (丙酸代谢) 内源 删除 prpE, birA genes (丙酸- mmCoA) 内源 超表达 编码6dEB合成酶的质粒图 6-dEB的产量已达到红霉素工业菌株的生产水平 本实验的成功是生物学诸多技术的综合，它包含了对6-dEB分子水平的催化，对E. coli 基因组和生理功能的了解等，强调了学科交叉的重要性。 抗生素的产生菌大多是好氧的，因此为保证其生长和有效地产生抗生素，必须保证氧气的充足供应。在大规模的发酵种，常需要不断地添加氧气以满足细胞生长和代谢。然而在培养基中，氧气的溶解度低。工业上常通过改良生物反应器(如改变搅拌浆的形状，增加档板和搅拌功率）或增加通气量，但这些设备的要求高，能耗大。 E. 引入异源基因，改善培养和生产工艺 血红蛋白基因在放线菌中的应用 将从透明颤菌中考虑的血红蛋白基因(vhb) 转至天蓝色链霉菌发现，菌体可在限氧的条件下生长，而且其中放线紫红素的产量增加了十倍。 vhb在Sac. erythraea中表达，可将红霉素的产量提高60%。 将vhb基因转至头孢菌素产生菌中，不仅提高了工程菌对氧气的利用量，而且大幅度提高了抗生素的产量。 在好氧菌透明颤菌中发现血红蛋白为氧气携带者，能促进氧气扩散到细胞末端的氧化酶上，这使得细胞在缺氧状态下也可能良好生长。 以DNA改组为代表的体外定向进化(directed evolution) 定向进化不需事先了解酶的空间结构和催化机制, 通过模拟自然进化机制, 以改进的诱变技术结合确定进化方向的选择方法，在体外改造酶基因，定向选择有价值的非天然酶。短期内可以在试管中完成自然界需要几百万年的进化过程，是发现新型酶和新的生理生化反应的重要途径。 目的：增加酶的底物专一性、立体选择性、比活、稳定性、溶剂耐受性、增加pH范围，以及这些特性的组合。 The fundamental rule of directed evoluti