第五章 固定化酶和固定化细胞(下)新PPT.ppt

esp： 酶与载体结合后，可以长期保存。如游离的胰凝乳蛋白酶在pH4.1，4℃保藏4个月后残留的活力只有2％，而偶联于琼脂糖后经同样处理可残留82％的活力。这对酶制剂的贮存和运输有重要意义。 esp： 将巨大芽孢杆菌青霉素酰化酶固定到聚丙烯腈纤维载体上。将酶于0.05 mol／L的磷酸缓冲液（pH 7.5）中分别在不同温度下保温6小时，测定酶活力。固定化酶在50 ℃以下稳定，天然酶在40 ℃以下稳定。固定化酶的热稳定性优于天然酶。 1.固定化酶；2. 天然酶 酶固定化后，抗变性剂（尿素、盐酸胍、有机溶剂等）能力提高，甚至在一定条件下出现激活。 固定化酶对蛋白酶的水解作用的抵抗力也比天然酶高。见下表： 残留活力（％）? 天然氨基 与DEAE-纤维素 与DEAE-葡聚糖 酰化酶 结合的酶 结合的酶 胰蛋白酶 23 33 87 蛋白酶-P 48 53 88 2 、固定化后酶稳定性提高的原因： a. 固定化后酶分子与载体多点连接。 b. 酶活力的释放是缓慢的。 c. 抑制自降解，提高了酶稳定性。 （二）最适条件变化 1.固定化酶的最适pH变化 酶固定化后，对底物的最适pH和pH活性曲线常常发生偏移。一般说来，用带负电荷载体（阴离子聚合物）制备的固定化酶，其最适pH值较游离酶偏高。反之，使用带正电荷的载体其最适pH值向酸性偏移 pH对固定化前后天冬酰胺酶 活力的影响 1.固定化酶；2.游离酶 pH对酶活性的影响： （1） 改变酶的空间构象 （2）影响酶的催化基团的解离 （3）影响酶的结合基团的解离 （4）改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或结合后不能生成产物。 pH对固定化酶的影响 1） 载体带负电荷，pH向碱性方向移动。载体带正电荷，pH向酸性方向移动。  微环境是指在固定化酶附近的局部环境，而把主体溶液称为宏观环境。 pH的变化 2）产物性质对体系pH的影响 催化反应的产物为酸性时，固定化酶的pH值比游离酶的pH值高；反之则低。 2.最适温度变化 固定化酶的最适温度一般比游离酶高，提高的程度与载体性质有关。 如氨基酸酰化酶固定于DEAE-纤维素，最适温度提高7℃，固定于DEAE-葡聚糖可升高12℃，达72℃。 一般温度每升高10℃，反应速度可提高1－2倍，所以固定化酶可在较高温度下催化，从而加快反应速度。而且在较高温度下反应还可避免微生物污染。 （三）专一性的变化 催化小分子底物的酶固定化后专一性一般不变，但底物为大分子的酶，如淀粉酶、蛋白酶等，固定化后专一性可能发生变化。其产物可能与游离酶不同，应用时需注意。 糖化酶用CM－纤维素叠氮衍生物固定后，相对分子质量8000的直链淀粉的活性为游离酶的77％，相对分子质量50000的只有17％。 （四）相对活力的变化 固定化酶的活力在多数情况下比天然酶小，其专一性也能发生改变。 例如、用羧甲基纤维素作载体固定的胰蛋白酶，对高分子底物酪蛋白只显示原酶活力的3%，而对低分子底物保持不变。所以，一般认为高分子底物受到空间位阻的影响比低分子底物大。 （五）米氏常数的变化 固定化酶的Km与游离酶的Km有些变化，有些变化很大。使用载体结合法制成的固定化酶Km变化的原因，有时主要是载体与底物间的静电作用的缘故。 三、评价固定化酶的指标 1. 固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的酶活力单位。 或：单位面积（cm2）的酶活力单位表示（酶膜、酶管、酶板）。 2. 操作半衰期：衡量稳定性的指标。 连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需要的时间（t1/2） t1/2=0.693t/2.303log(E 0/E) t:固定化酶反应（应用）的时间 E 0原有固定化酶的酶活力 E反应t时固定化酶的酶活力 E 0/E时固定化酶的酶活力残留分数 三、评价固定化酶的指标 3. 或称偶联效率，活力保留百分数。一般用蛋白量来衡量。 4. 5.相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力 四 、固定化酶的活力测定方法介绍 1. 振荡测定法： 2. 酶柱测定法： 退出 Enzyme Engineering酶工程 第五章 固定化酶 第一节 概述 第二节 酶固定方法 第三节 微生物、植物、动物细胞的固定方法 第四节 固定化原生质体和辅酶 第五节 固定化酶的性质 第