第一章 蛋白质化学PPT.ppt

纸电泳 操作 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 三、蛋白质的胶体性质 蛋白质分子的颗粒直径已达1~100nm，处于胶体颗粒的范围。因此，蛋白质具有亲水溶胶的性质。 蛋白质溶液具有胶体的特征：丁达尔效应、布朗运动以及不能通过半透膜等性质 蛋白质胶体溶液的稳定因素： 1.同种蛋白带同种电荷，相互排斥 2.水膜弹性 蛋白质颗粒的表面电荷和水化膜 + + + + + + + 带正电荷的蛋白质 － － － － － － － － 带负电荷的蛋白质 在等电点的蛋白质 + + + + + + + + 带正电荷的蛋白质 － － － － － － － － 带负电荷的蛋白质 不稳定的蛋白质颗粒 酸 碱 酸 碱 脱水作用 脱水作用 脱水作用 ； 透 析 * 透析(dialysis)：利用蛋白质不能透过半透膜的性质，可用羊皮纸、火胶棉、玻璃纸等来分离纯化蛋白质。 蛋白质分子相互聚集而从溶液中析出的现象称为沉淀（precipitation）。 变性后的蛋白质由于疏水基团的暴露而易于沉淀，但沉淀的蛋白质不一定都是变性后的蛋白质。 四、蛋白质的沉淀 1、可逆沉淀： Pr从胶体溶液中析出 温和条件，改变溶液pH或Pr所带电荷 Pr结构和性质没有变化 适当条件下可重新溶解 ——非变性沉淀 pI沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等 2、不可逆沉淀 强烈沉淀条件 破坏Pr胶体溶液稳定性 也破坏Pr结构和性质 沉淀不能再重新溶解 ——变性沉淀 如加热沉淀、强酸/碱沉淀、重金属盐 和生物碱沉淀等 有机溶剂沉淀 如酒精、丙酮等可使蛋白质产生沉淀，是由于这些有机溶剂和水有较强的作用，破坏了蛋白质周围的水膜，从而产生沉淀。 重金属盐沉淀 与带负电荷蛋白质结成不溶性盐 生物碱试剂和某些酸类沉淀 与带正电荷蛋白质生成不溶性盐 加热变性沉淀 天然结构解体，疏水基外露， 破坏水化层及带电状态 高浓度盐沉淀 如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等可破坏蛋白质周围的膜，同时中和蛋白质分子的电荷，从而使蛋白质沉淀。 在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以破坏蛋白质的胶体性质，使蛋白质从溶液中沉淀析出，称为盐析（salt precipitation）。 盐 析 法 分段盐析： 半饱和硫酸铵溶液可沉淀分子量较大的血浆球蛋白，而饱和硫酸铵溶液可沉淀分子量较小的血浆清蛋白。 因此，使用不同浓度的硫酸铵溶液就可将分子量不同的蛋白质进行初步分离。 五、蛋白质的变性 天然蛋白质受理化因素的作用时，次级键受到破坏，导致天然构象的破坏（空间结构被破坏不包括肽键断裂即一级结构的破坏）， 使蛋白质的生物活性丧失的现象称为蛋白质变性,称为蛋白质的变性(denaturation)。 引起蛋白质变性的因素有： ① 物理因素：高温、高压、搅拌、研磨、据烈振荡、紫外线、X射线、超声波、电离辐射等； ② 化学因素：强酸、强碱、尿素、胍、三氯乙酸、磷钨酸、苦味酸、重金属盐、生物碱试剂、去污剂等 。 变性蛋白质的性质改变： ① 物化性质：旋光性改变，溶解度下降，沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等； ②生物学性质：肽链松散、反应基团增加、官能团反应性增加、易被蛋白酶水解、原有生物学活性丧失，抗原性改变。 蛋白质变性的可逆性： 蛋白质在体外变性后，绝大多数情况下是不能复性的； 如变性程度浅，蛋白质分子的构象未被严重破坏；或者蛋白质具有特殊的分子结构，并经特殊处理则可以复性。 胃蛋白酶的变性与复性 降温到37℃ 加热80~90℃ 失去溶解性、也无消化蛋白酶的能力 变性状态 胃蛋白酶 恢复溶解性及消化蛋白酶的能力 天然构象 六、蛋白质的颜色反应 （一）双缩脲反应 双缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜反应生成红紫色络合物，此反应成为双缩脲反应。 蛋白质中含有许多和双缩脲结构相似的肽键，因此也能起双缩脲反应。 可根据反应生成的颜色在540nm处比色，定量测定蛋白质。 （二）米伦氏反应 米伦试剂：硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸和亚硝酸的混合物。 蛋白质+米伦试剂→白色沉淀→红色 △ 酚类化合物有此反应，酪氨酸含有酚基，故含有酪氨酸的蛋白质都有此反应。 （三）乙醛酸反应 蛋白质溶液+乙醛酸→两夜间紫色环 凡含有吲哚基的化合物都有此反应； 色氨酸及含有色氨酸的蛋白质都有此反应。 浓硫酸 （四）坂口反应 精氨酸含有胍基+次氯酸钠/α-萘酚→红色 此反应可用来鉴定含有精氨酸的蛋白质， 也可用来定量测定精氨酸含量。 氢氧化钠 （五）酚试剂（福林试剂）反应 酪氨酸含有酚基+磷钼酸+磷钨酸→蓝色 此反应可用来定量测定蛋白质含量。 2、同源蛋白质的物种差异与生物进化 同源蛋白质：在不同物种中具有同种或