用层析法分离复性包涵体.pdfVIP

用层析法分离、复性包涵体 摘要： 这里提出了一种用柱层析直接从 Ecoli 破碎原浆中分离纯化及复性包涵体的新 方法。传统的离心分离一步凝胶过滤所取代。分离的原则是选择合适的介质，使之 仅排阻包涵体颗粒，而其它的组份都可以进入并穿过凝胶介质。在新的复性方法中， 逐步递减的变性剂（urea 或 Gu-HCl ）梯度与逐步递增的pH 梯度相结合，通过凝胶 过滤（排阻上限小于蛋白质分子量）层析来进行复性。溶解在高浓度变性剂及低 pH 中的变性样品，然后加入到梯度形成好的层析柱中。在层析过程中，变性蛋白质的 下行速度大约是变性剂下行速度的 3 倍。因此，变性蛋白会经过已经形成好的变性 剂和 pH 梯度，并逐步脱除变性剂，逐步地升高 pH ，这样可以促进正确的折叠。梯 度的形状和程度，及流速都会影响复性率，而且可以针对不同蛋白质进行调节，以 得到优化的条件。我们在此实验中选择的目标蛋白质为大肠杆菌表达的 scFv 融合蛋 白包涵体。 Rudolph 和 Lile 的综述已经对蛋白质的体外复性做详细的介绍[1]。传统的分离、 复性方法如：分步离心，稀释和透析通常很耗时且复性率低。本文中介绍了以凝胶 过滤为基础发展起来的分离及复性方法。此方法的一个优势是变性剂的脱除，流速 及 pH 的变化可以很容易的调节。大肠杆菌表达的 scFv 融合蛋白质包涵体。ScFv 片段在Eocli 中表达量很高，但经常会形成包涵体。因此需要进行复性。 材料与方法 脲（urea ）、DTT 、PMSF 、溶菌酶（lysozyme ）、精氨酸（arginine ）、Triton X-100 和 DNAse 购于 Sigma。 GSSG,GSH 购于 Roche 。Berol 185 购于 Akzo Nobel 表面化 学公司，Sweden。所有层析介质均为Amersham Pharmacia Biotech 公司产品。其它 试剂均为分析纯。实验用水为 Millipore 纯水系统生产。所有层析实验在 AKTA Explorer 层析工作站上进行。用于 scFv57P 活性检测的 Biacore 2000 为 Biacore(Sweden) 公司生产。电泳设备采用 Amersham Pharmacia Biotech 公司的 PhastSystem 电泳设备。 克隆与表达 scFv57P Fab57P 的scFv 抗体片段是通过VH-linker-VL 的走向构建成pscFvHL57P[2] 。载 体选择用 pscFew ，它有一段可以使蛋白质表达到周质的pelB 引导序列；一个 15-aa linker, VH-SRGKSSGSGSESKST-VL, 来连接抗体可变区的两个 domain ；C-terminal 的B10 tag 用于免疫识别[3]。在pscFvHL57P 中VH domain 被设计成Xho I-Xba I 位点， PCR 扩增目标片段， VL domain 被设计成 SacI-SpeI 位点。PCR 扩增目标片段。 ScFv57P 抗体片段通过前人的方法表达在E.coli 中[4]。通过 Western blot 鉴定（用 抗 B10 的抗体），发现表达的 scFv57P 形成对还原剂敏感的聚集体。经 BIAcore 鉴 定细胞周质提取物原液，发现活性抗体片段的产量为 5-10 ug/l [5] 。 在 pBAD/Thio-TOPO 中克隆及过量表达 scFv57P 以质粒pscFvHL57P 为模版，将编码 scFv57P 的目的片段基因用 PCR 扩增。正 相引物为（5’-acactgggatccatggcccaggcccaggtgaaactgctcgag-3’ ），其中包含了 T7 RNA polymerase 的增强子和 scFv57P 中Vh 的起始基因片段（下划线部分）。反相引物为 5’-cacgatgcggccgctcgagtcgactaaacgttcgcgaccgccctgacg-3’用来保持原始 pscFvHL57P 构 建的 C 端的 B10 tag （下划线部分）。扩增产物在N 端多出 4 个氨基酸，在 C 端多出 8 个氨基酸（在 B10 tag 之后），这是为了增加了几个不同的单一的酶切位点，简化 后继的克隆表达。PCR 过程如下：95℃